【Serumwerk】从大鼠、小鼠、豚鼠和兔血中分离多形核白细胞Polymorphonuclear leukocytes密度屏障
从大鼠、小鼠、豚鼠和兔血中分离多形核白细胞不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™（60%，不含碘二醇）-使用前轻轻摇瓶
B. 缓冲盐水（等渗）：0.85%（w/v）氯化钠，10 mM Tricine-NaOH，pH 7.0
C. 含EDTA的缓冲盐水
D. 20%（w/v）聚蔗糖（右旋糖酐），MWt 450,000溶液B
E. 红细胞裂解溶液
试验方法
1．首先制备1.077 g/ml低渗密度屏障:稀释溶液B与水(2.5体积 + 0.5体积)，然后将2.7 体积的OptiPrep™与9.3体积的稀释盐水溶液混合。
2．通过心脏穿刺将血液收集到含有与预期血容量相等的溶液C的注射器中。
3．将9.25体积的血液与0.75体积的溶液D混合。
4．使血液在室温下静置30 min，然后从聚集的红细胞球上方移除富含白细胞的血浆(LRP)。
5．在步骤1中制备的富含白细胞的血浆的第1层体积超过1.077 g/ml密度屏障的0.5体积。
6．在室温下以700 g离心20 min并通过吸入去除颗粒上方的所有液体。
7．将颗粒悬浮于5体积的溶液E中并在37℃孵育7分钟裂解红细胞。
8．将pmn在250-300 g下沉淀15分钟，并根据需要在溶液B或工艺中重新悬浮。
方法注释
1. 溶解多聚蔗糖的最佳方法是将液体缓慢添加到固体中，在添加每1-2 ml等分后用玻璃棒搅拌。
2. 如果有渗透压计，检查这些溶液的渗透压。应尽可能准确地制备稀释剂。OptiPrep™是相当粘稠的，当用自动移液器分配容积时，液体应该被吸入，并从移液器尖端缓慢地喷出。如果单个核细胞明显流失到颗粒中，则尝试略微增加屏障的密度(2.8体积的OptiPrep™和9.2体积的稀释盐水)。
3. 与人的静脉穿刺采血相比，小鼠和大鼠的血液(心脏穿刺采血)都很容易发生凝血。即使注射器中有抗凝剂，也可能存在凝血问题。如果将含有EDTA (4 mM)的生理盐水以所需最终浓度(溶液C)的两倍预充到注射器中，直接稀释血液，则可将此稀释到最低限度。如果不使用这种方法，则在继续步骤3之前，用等量的溶液B稀释血液。我们发现EDTA是最可靠的，并使用它在2毫米的最终浓度;其他工人使用浓度高达4或5 mM的抗凝剂或柠檬酸盐或肝素等其他抗凝剂。
4. 在此分离中也可能使用全血而不是LRP，并通过在多聚蔗糖中聚集将红细胞从小球中去除。虽然这种方法相当少见，但它确实缩短了从单核细胞和血小板中梯度分离PMN的时间。
5. 如果在心脏穿刺时血液没有被稀释，通常添加等容量的6% (w/v)多聚蔗糖，尽管该浓度的一半通常有效。另一方面，如果血液在心脏穿刺时被稀释，使用小体积的高浓度聚蔗糖溶液(20%)可以最大限度地减少血液的进一步稀释;通过反复轻柔反转，确保黏性多聚蔗糖与血液充分混合。如果聚集不理想，则将20%多聚蔗糖的体积翻倍。
6. 可使用其它红细胞聚集剂:以1:10的与全血的体积比添加2% (w/v)甲基纤维素;Song等人在5 ml肝素化全血中加入2 ~ 3 ml Plasmagel;第三种选择是将等容量全血和6% (w/v)羟乙基淀粉置于0.9% NaCl中。
7. 由于PMN颗粒化可能引起的功能问题，一些工作人员使用小体积的致密垫来防止这种情况;用步骤1中制备的2体积的盐水稀释1体积的OptiPrep™即可简单地制备密度为1.11 g/ml的缓冲液。因此，在15 ml的锥形管中，典型的分离方法为LRP/生理盐水5 ml、1.077 g/ml密度屏障2.5 ml和缓冲液1.0 ml。对于小体积的小鼠血液，使用较小体积(较窄)的管。
8. 如果使用了缓冲，则去除PMN带上方的所有液体，并使用与一段特氟龙管相连的注射器，尽可能多地去除缓冲。
9. 另一种方法是用冰冷的蒸馏水裂解30秒，然后加入等量的双倍强度的生理盐水。
10. 大鼠PMN已使用这种基于OptiPrep™的方法制备
其他方法
1. McClelland等人以方案中所述的方式将LMF调整为25% (w/v)并在Beckman NVT65近垂直转子中以180,000g离心2.5 h。Kurochkin等人使用相同的转子，但离心3.5小时，LMF与等体积的工作溶液混合，其中包含5体积的OptiPrep™和1体积的0.16 M蔗糖，12% (w/v) PEG1500, 60 mM Mops, pH 7.4, 6 mM EDTA, 6 mM DTT和0.6%乙醇。
2. He等人使用Hepes缓冲液而不是Mops，并在Beckman 50.2Ti固定角度转子中180,000g离心3小时来研究过氧化物酶体中胆汁酸CoA(氨基酸n -酰基转移酶)的表达和特征。
3.Morel等人从人肝母细胞瘤(HepG2)细胞中分离出过氧化物酶体。匀浆缓冲液含有0.25 M蔗糖，10 mM三乙醇胺-乙酸，pH 7.8，在180,000g离心4.5 h。对人谷胱甘肽s -转移酶kappa基因和蛋白进行表征。
4. 来自CHO细胞的核后部分而不是LMF按照通常的方案处理。
5. 在带有39 ml管(贝克曼50.2Ti)的大体积固定角度转子中，在150000 g下进行4 h分级。
相关产品推荐
其他细胞品类
别划走，精彩继续
长按识别
添加一对一专属技术支持
扫码进群
咨询详细产品信息
点在看，传递你的品味
