【Serumwerk】从大鼠、小鼠和兔血中分离单个核细胞（Mononuclearcell）——密度屏障
从大鼠、小鼠和兔血中分离单个核细胞不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™（60%，w/v碘二醇）-在使用前轻轻摇瓶。
B. 缓冲盐水（等渗）：0.85%（w/v）氯化钠，10 mM™，pH 7.0
试验方法
1. 配制密度屏障:稀溶液B与水(体积比分别为2.5:0.5);该溶液具有约242 mOsm的渗透摩尔浓度。使用该溶液稀释OptiPrep™，体积比分别为2.7:9.3。
2. 通过心脏穿刺收集血液到含有抗凝剂的注射器中;EDTA、柠檬酸盐、ACD或肝素通常令人满意。
3. 用等体积的B溶液稀释血液。
4. 在15 ml离心管中，将6 ml稀释的血液小心地分层超过3 ml密度屏障(避免在界面混合)。或者，可以使用注射器和金属套管将密度屏障置于血液底层。
5. 大约700 g离心20分钟。20°C的摆动斗转子。
6. 离心后，MCs在界面处形成一个尖锐的带。
7. 将等离子体层移至MC带正上方，然后恢复MC带。这是最好的实现使用注射器连接金属套管(内径0.8毫米)。
8. 用2体积的溶液B稀释细胞收获物以降低溶液的密度;通过400 g离心10 min将细胞制成颗粒。
9. 将MC颗粒重新悬浮于溶液B中，并按要求进行处理。
方法注释
1. 盐水溶液中的Tricine可被任何合适的有机缓冲液(例如HEPES)取代。
2. 如果有渗透压计，检查这些溶液的渗透压;为265 mOsm(±10 mOsm)。应尽可能准确地制备稀释剂。如果单个核细胞明显流失到颗粒中，则尝试略微增加屏障的密度(2.8体积的OptiPrep™和9.2体积的稀释盐水)。
3. 大鼠血液尤其容易凝固，可能需要比人类血液更高浓度的抗凝剂。我们建议使用EDTA，并发现EDTA的最终浓度应为3-4 mM。
4. 对于其他血容量，稀释后的血液与密度屏障的比率为2:1。对于小体积的小鼠血液，使用较小体积(较窄)的管。
5. 扁平金属套管可以从许多外科器械公司购买。
6. 还可通过使用OptiPrep™浮选分离来自大鼠和小鼠血液的MC。
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