【Serumwerk】组织中分离单核细胞（Hyaline leukocyte）沉积到一个密度屏障上

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Serumwerk Bernburg AG

Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

组织中分离单核细胞不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

沉积到一个密度屏障上

溶液制备

A. OptiPrep™（60%，不含碘二醇）-使用前轻轻摇瓶

B. 缓冲盐水

等渗屏障溶液

用溶液B稀释溶液A，得到密度较低的等渗溶液。可调节该屏障溶液之密度以提高单个核细胞之纯度或产量。已发表的方法引用的% (w/v)碘克沙醇浓度为12.6%，其密度约为1.072 g/ml，15%,其密度约为1.084 g/ml，也包括标准的1.077 g/ml屏障，对于肠细胞来说，在1700 g下使用密度更低的屏障(1.055 g/ml) 10 min。离心条件通常在600-1000 g范围内进行10-20 min。

低渗的1.077 g/ml屏障溶液

用水稀释溶液B（2.5体积+0.5体积），然后将2.7体积溶液A与9.3 体积稀释的盐水溶液混合。

试验方法

1．把2体积细胞悬浮液分层位于1体积密度屏障之上。

2．在室温下以750 g离心20 min。

3．允许转子在没有刹车的情况下减速，并从接口获取MCs。

在两层梯度中的沉积

溶液制备

A. OptiPrep™ (60%, w/v iodixanol)

B.培养基（RPMI 1640）

试验方法

1．使用前轻轻摇晃OptiPrep™

2．将溶液A和B分别按以下体积比(1:8 .8)和(1:3.5)配制成1.051和1.078 g/ml两种溶液。

3．将细胞悬浮于1.051 g/ml溶液中，并在等体积的1.078 g/ml溶液上分层。

4．在室温下以750 g离心20 min。

5.允许转子在没有刹车的情况下减速，并从接口获取MCs

浮选策略

溶液制备

A. OptiPrep™ (60%, w/v iodixanol).

B. 培养基(RPMI 1640)保持Hepes(游离酸)或Tricine作为100 mM原液在4°C；Hepes(2.38g)或Tricine(1.79g)/ 100毫升水。溶液B： 0.85 g NaCl溶于50 ml水中;加入10 ml Hepes或Tricine原液；用1 M NaOH调整到pH 7.2-7.4，最大可达100 ml。

试验方法

1．使用前轻轻摇晃OptiPrep™，将4体积的溶液A与2体积的溶液B混合，制成密度为1.215 g/ml的溶液。

2．将细胞悬浮于3.9 ml溶液B中，与2.1 ml 1.215 g/ml溶液温和但充分混合。

3．将1 ml溶液B置于顶部并以1500 g在4℃下离心20 min。

4．允许转子在没有刹车的情况下减速，并从接口获取MCs。

方法注释

1．该溶液等效于Optiprep 1.077并具有1.077 g/ml的密度和约265 mOsm的渗透压摩尔浓度。

2．样品的相对体积和密度势垒可能并不重要，但给定的比率被广泛使用。

3．等渗屏障上的分离应不依赖于温度，但由于在较低温度下粘度增加，较低温度可能需要进一步5分钟离心。低渗透介质的使用应在室温下进行，因为水在低温下通过渗透梯度的运动减少。

4．如果过多的Mc丢失到颗粒中，则可向上调整1.078 g/ml溶液的密度。Zellweger等使用1.052和1.076 g/ml的小肠和肝脏单个核细胞密度。

5．分离应不依赖于温度，但由于较低温度下粘度增加，较低温度可能需要进一步5分钟离心。

6．溶液A:溶液B的比率可根据关于MCs恢复的数据来调节。在步骤3中，可能将样品直接与OptiPrep混合，而不是与ρ = 1.215 g/ml介质混合;后者是选择的方法，因为OptiPrep与样品完全混合需要更剧烈的搅拌，这可能对细胞有害。