【Serumwerk】小鼠血液中分离单个核细胞——浮选法，碘二醇混合技术
小鼠血液中分离单个核细胞不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™（使用前轻轻摇动）
B. Tricine缓冲盐水（TBS）：0.85%氯化钠，10 mM Tricine缓冲盐水-NaOH，pH 7.4
试验方法
1．用CO2麻醉动物，心脏穿刺取血0.5 ~ 1.0 ml，注入含有0.1 ml 3.8% (w/v)枸橼酸抗凝剂的2 ml注射器。
2．0.25-0.5 ml血液:5.0 ml溶液B中加入1.5 ml OptiPrep™，混合均匀。然后将5.0 ml此培养基温和反复倒置加入小鼠血液中。
3．5 ml血液:用2.5 ml B溶液稀释，然后与1.25 ml OptiPrep™混合
4．将血液转移到合适的带帽管中;将0.5 ml B溶液分层置于顶部，并在1000 g下在20℃离心30分钟。
5．从弯月面向下收集PBMCs至距离细胞球约0.5 cm处。
6．用两体积的溶液b稀释悬浮液，并在300-400 g下将细胞颗粒化5-10分钟。
方法注释
1. 可以使用任何合适的缓冲液，但Tricine是许多细胞类型的缓冲液的选择。
2. 样品上的少量生理盐水对分离不是必需的，但它有助于从血浆上获取PBMCs。它还可以防止细胞在半月板处的管壁上聚集和粘附。
3. 与用这种方法纯化人PBMCs一样，细胞将被血浆中的血小板污染。可通过优先以低RCF (250-300 g持续10分钟)将细胞制成颗粒来实现从人PBMCs中部分去除血小板。细胞可以重新悬浮在生理盐水中，重复洗涤过程。对于小鼠PBMCs，这种方法是否令人满意尚不清楚。
4. 用等体积的溶液B稀释可完全去除人PBMCs中的血小板。分层使用碘克沙醇，ρ = 1.063 g/ml (5体积 OptiPrep™+ 22体积Solution B)， 350 g离心15 min, 20℃。血小板在界面下方形成一条宽带;将整个液体吸入并将PBMC颗粒重新悬浮于适宜培养基中。该方法已成功用于啮齿类细胞。
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