【Serumwerk】以DAPI为荧光标记物，在自生成的碘二醇梯度中分离质粒DNA
质粒DNA分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. 50 mM葡萄糖，25 mM三离子-HCl，pH 8.0,10 mM EDTA。
B. 溶解酵素
C. 0.1M氢氧化钠，1%（w/v）SDS（新鲜）
D. 3M醋酸钠，pH 4.8
E. 丙烷-2-醇（异丙醇）
F. 70%（v/v）乙醇
G. 1 mM EDTA，10 mM三盐酸，pH 7.5
H. OptiPrep™
I. 0.5%（w/v）DAPI
试验方法
粗质粒DNA的制备
1．通过2000 g离心20 min使细菌成球。
2．将颗粒重新悬浮于10 ml溶液A中，并添加溶菌酶至终浓度为5 mg/ml。
3．将悬浮液在室温下孵育10 min，然后加入20 ml溶液C；轻轻混合，在室温下孵育10分钟。
4．将混合物放入冰中，加入15 ml溶液D，孵育10分钟。
5．25,000 g离心30 min并小心去除含有质粒的上清液。
6．加入0.6体积的丙烷-2-醇；搅拌均匀，在-20℃保存至少30分钟。
7．2万g离心30 min收集沉淀DNA；将颗粒在F溶液中洗涤并最终溶解于10 ml G溶液中
质粒DNA纯化
1．向质粒溶液中添加OptiPrep™，使最终浓度为27% (w/v)碘克沙醇和DAPI达到0.005%。
2．将溶液转移到密封管上，用于合适的近垂直或低角度固定角度转子。本应用说明书中所给出之实例系具有在35万g下于5℃下离心12-15 h之低角度固定角度转子(管尺寸5 ml)。生成的梯度的密度分布如图1所示。
3．用紫外线照射器观察结果，并使用皮下注射器去除质粒DNA条带。
分析
从碘克沙醇梯度中去除的质粒DNA样品可以直接电泳，也可以在琼脂糖凝胶上用适当的限制性核酸酶消化后进行电泳。琼脂糖凝胶图谱显示，EtBr-CsCl和dapi -碘克沙醇梯度的质粒DNA纯度非常相似。来自CsCl梯度的样品需要在稀释后通过乙醇沉淀或在电泳前通过旋转柱进行脱盐;在氯化铯纯化样品中观察到的质粒DNA涂片是由于样品中残留氯化铯所致。
方法注释
1. 其他具有较短沉降路径长度的转子可能需要显著较少的时间来自生成梯度和带DNA。
2. 在我们熟悉的EtBr- cscl梯度中，质粒DNA条带比变性线性染色体DNA条带密度大，因为它与较少的EtBr结合。在DAPI碘克沙醇梯度中，天然质粒DNA条带将被观察到为明亮的浅蓝色条带，而变性染色体DNA则被观察到为下方较弱的条带。
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