【Serumwerk】过氧化物酶体（Peroxisome）纯化——不连续的梯度或密度屏障
过氧化物酶体纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. OptiPrep™稀释剂：0.25 M蔗糖，10 mM EDTA, 1% (v/v)乙醇，100 mM Mops-NaOH, pH 7.2
C. 54% (w/v)碘克沙醇(ρ = 1.291 g/ml)工作液：9体积OptiPrep™+ 1体积溶液B
D. 均质培养基：0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 0.1% (v/v)乙醇，10 mM Mops-NaOH, pH 7.2。
E. 梯度溶液：采用8.7 + 1.3 v/v和6.0 + 4.0 v/v混合溶液C和D，配制成两种稀释溶液C，含47%碘克沙醇(ρ = 1.257 g/ml)和32%碘克沙醇(ρ = 1.185 g/ml)。
试验方法
所有的解决方案和执行所有的操作，在0-4℃。
1．用剪刀将肝脏(湿重约10克)切碎，然后转移到Potter Elvehjem (特氟龙和玻璃)匀浆机中。
2．将肉糜匀浆于溶液D中(每2.5 g组织使用10 ml培养基)，使用杵大约敲击6下(500-700转/分)。
3．将匀浆在固定角度的转子中以3000g离心10分钟，使细胞核和重线粒体成球。
4．将上清液以17000g离心10-15分钟，产生轻线粒体颗粒。
5．使用宽松的Dounce匀浆器(杵拨2-3下)将该颗粒重新悬浮在约4.0 ml的溶液D中，并添加等体积的47%碘克沙醇。该悬浮液的折射率为1.3782；如有必要，可使用方案C或D调整到此值。该悬浮液之密度系约1.145 g/ml。
6．将大约14 ml的悬浮液转移到一个17 ml的管中，用于一个合适的摆动桶转子，并在底层加入2 ml 32%碘克沙醇。如有必要，用悬浮液或溶液D填充管。在110,000g下离心2小时。
7．过氧化物酶体带向管的底部，部分在32%碘克沙醇层内，部分作为松散的颗粒。抽吸并丢弃32%层以上的液体，然后收获这一层和过氧化物酶体颗粒。
方法注释
1. 溶液E的密度可以根据操作人员的要求进行调整，如果降低，更多的过氧化物酶体会成球；如果增加，过氧化物酶体将主要在样品和屏障之间的界面带。如果较可取在界面处显带过氧化物酶体，则可取在样品底部再加2 ml约25%碘克沙醇层。根据操作者的决定，蛋白酶抑制剂可包括在任何或所有介质中。
2. 转子的选择不是特别关键；Ghosh和Hajra使用了固定角度的旋翼。分离可适用于较大或较小体积的转子。
3. 可将该颗粒在溶液D中再均质化并重复离心。
其他梯度格式
Lamhonwah等人将轻度线粒体悬液调整为稍高浓度的碘克沙醇(27.5%)，并省略了较致密的缓冲液；将5 ml该物质在250000 g下在摇桶转子中离心4 h以使过氧化物酶体成球。相比之下，Mi等人将LMF调整为28%碘克沙醇(15 ml)，并用2 ml 50%碘克沙醇将其下层，因此在131,000 g浓度下2小时后，过氧化物酶体在界面上条带。这种格式可能适用于任何来源的LMFs—贻贝过氧化物酶体使用相同的双层格式。将含有22.5%碘克沙醇(4.5 ml)的LMF夹在20%碘克沙醇和27.5%碘克沙醇(各2 ml)之间的三层格式中，鸡胚肝过氧化物酶体条带位于最密集的层。
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