【Serumwerk】过氧化物酶体（Peroxisome）纯化——自生成梯度
过氧化物酶体纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 均质培养基:0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 0.1% (v/v)乙醇，10 mM Mops-NaOH, pH 7.4
C. 稀释培养基:0.25 M蔗糖，6 mM EDTA, 0.6% (v/v)乙醇，60 mM Mops-NaOH, pH 7.4
D. 50%碘克沙醇工作液(ρ = 1.272 g/ml): 5体积溶液A与1体积溶液C混合
试验方法
在0-4℃下执行所有操作。
1. 用剪刀将肝脏切碎，用溶液B(每2.5 g组织用10 ml培养基)转移到Potter-Elvehjem(聚四氟乙烯和玻璃)蒸煮器中。使用杵大约敲击6下使其均质化。
2. 3000 g离心10分钟，将细胞核和重线粒体打成颗粒。可将该颗粒在溶液B中再均质化并重复离心。
3.将上清液以17,000 g离心10-15分钟，产生“轻线粒体颗粒”。
4.使用宽松的Dounce匀浆器(杵击2-3下)将该颗粒重新悬浮在溶液B中。调整至每10克组织约15 ml；再与等体积的溶液D(终碘克沙醇浓度= 25%；ρ = 1.150 g/ml)混合。
5. 转移到合适的管(10-14毫升)，用于垂直、近垂直或低角度(小于24°)的固定角转子和离心机，最低180,000g。形成梯度所需的时间取决于转子的类型；在180,000g时，大约是3小时，在较大的g力下，时间可以减少。
6. 允许转子从3000 rpm开始减速，无需制动，并通过向上位移或管道穿刺，或使用注射器收集梯度。
方法注释
1. 根据操作者的决定，蛋白酶抑制剂可包括在任何或所有介质中。
2. 固定角度的转子的角度越低，就越适合创建自生成的梯度(理想的角度应该是24°)。然而，相当少的现代固定角转子符合这一规格，在这种情况下，可能需要使用更小的容积管(最好是贝克曼g-Max适应管，减少管的高度，而不是其直径)，以限制沉降路径的长度。
3. 虽然产生梯度需要比使细胞器在预先形成的梯度中带大得多的g力；垂直转子的使用具有非常短的沉降路径长度，这意味着在较低的g力下，细胞器上的静水压力并不比摇斗转子大。
4. 在自生成的梯度中，过氧化物酶体纯化所需的精确条件在很大程度上取决于转子的类型。任何垂直转子，具有25毫米的沉降路径长度将提供一个非常简单和有效的系统；在约35万gav时，分离将在1-2小时内发生。垂直和近垂直转子可以产生一系列密度剖面形状。
5. 线粒体和过氧化物酶体的最佳分离取决于在管的中间形成一个相对浅的梯度和底部形成一个尖锐的梯度，以防止过氧化物酶体撞击管壁。
6. 在使用空白梯度之前，一定要检查在特定转子中产生的梯度密度分布，并根据需要调整离心条件。折射率(RI)是测定密度最准确的方法。如果没有折射计，那么吸光度测量是一个可能的替代方法。
7. 一旦确定了过氧化物酶体的条带位置，自生成梯度的再现性是如此之高，以至于可以使用注射器从梯度的底部获取标准体积。
其他方法
1. McClelland等人以方案中所述的方式将LMF调整为25% (w/v)并在Beckman NVT65近垂直转子中以180,000g离心2.5 h。Kurochkin等人使用相同的转子，但离心3.5小时，LMF与等体积的工作溶液混合，其中包含5体积的OptiPrep™和1体积的0.16 M蔗糖，12% (w/v) PEG1500, 60 mM Mops, pH 7.4, 6 mM EDTA, 6 mM DTT和0.6%乙醇。
2. He等人使用Hepes缓冲液而不是Mops，并在Beckman 50.2Ti固定角度转子中180,000g离心3小时来研究过氧化物酶体中胆汁酸CoA(氨基酸n -酰基转移酶)的表达和特征。
3.Morel等人从人肝母细胞瘤(HepG2)细胞中分离出过氧化物酶体。匀浆缓冲液含有0.25 M蔗糖，10 mM三乙醇胺-乙酸，pH 7.8，在180,000g离心4.5 h。对人谷胱甘肽s -转移酶kappa基因和蛋白进行表征。
4. 来自CHO细胞的核后部分而不是LMF按照通常的方案处理。
5. 在带有39 ml管(贝克曼50.2Ti)的大体积固定角度转子中，在150000 g下进行4 h分级。
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