【Serumwerk】过氧化物酶体（Peroxisome）纯化——连续梯度
过氧化物酶体纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 均质培养基：0.25 M蔗糖，1mM EDTA, 0.1% (v/v)乙醇，5 mM Mops pH 7.2。
C. 6 mM EDTA, 0.6%乙醇，30 mM mop, pH 7.2。
D. 1 M蔗糖。
E. 梯度解：由A、C、D和水的使用量，这些体积比:
E1: 5 + 0.6 + 0.4 + 0.0(50%碘克沙醇)
E2: 4 + 0.6 + 0.7 + 0.7(40%碘克沙醇)
E3: 2 + 0.6 + 1.1 + 2.3(20%碘克沙醇)
试验方法
在0-4℃下执行所有操作。
1．用剪刀将肝脏切碎，用溶液B(每2.5 g组织使用10 ml培养基)转移到波特-艾维杰姆匀浆机中。使用杵的大约6次(500-700转/分)使其均质化。
2．将匀浆在固定角度的转子中以3000 gav离心10分钟，使细胞核和重线粒体颗粒化。可将该颗粒在溶液B中再均质化并重复离心。
3．以17000 gav离心上清10-15分钟。
4．使用宽松的Dounce匀浆器(杵的2-3次敲击)将17,000 g颗粒重新悬浮在溶液B中。调整到每克组织约0.5毫升的体积。
5．使用双腔梯度发生器或Gradient Master，从厚壁聚碳酸酯管中各9 ml梯度溶液E2和E3制备线性梯度溶液，用于36-40 ml固定角转子，并在每个梯度溶液的底层加入2 ml梯度溶液E1。
6．将3 ml悬浮液置于每个梯度上并以105,000 gav离心1 h。
7.允许转子在没有刹车的情况下从1000转/ min开始减速，首先在1ml分数密集端收集梯度。
方法注释
1．1 M蔗糖的可变体积使每种溶液保持等渗。保存这些溶液并在0 ~ 4℃进行后续操作。根据操作者的决定，蛋白酶抑制剂可包括在任何或所有介质中。
2．可以使用薄壁管，但可能需要一些封头或密封装置。
3．通过在管的底部小心地引入一个狭窄的金属套管(连接到蠕动泵)，可以先将梯度管的密端卸下。薄壁导管可通过穿刺收集。
碘克沙醇梯度分离的替代离心/梯度格式
1. Joly等人使用完全相同的碘克沙醇梯度，但在Beckman SW41摇桶转子中以125,000 g离心1小时。
2. 轻而密的过氧化物酶体已在非线性连续梯度中分解。从1.12、1.155、1.19、1.225和1.26 g/ml(相当于18.5%、26%、32.5%、40.5%和47.5%碘克沙醇)的不连续样品中通过液氮冷冻(-20℃保存)，然后快速解冻(约30分钟)生成。所用溶液的体积分别为10、7、6、3和4 ml，粗馏份在其上分层。在Beckman VTi50转子中，在39,000 gmax离心30分钟后，轻的过氧化物酶体在约1.21 g/ml和密集的过氧化物酶体在约1.24 g/ml。
3. Antonenkov等人使用碘克沙醇梯度作为生产高纯度过氧化物酶体的最后一步，几乎没有任何污染。在Beckman VTi50转子的管中，最初的不连续梯度包括20%、25%、30%和35% (w/v)碘克沙醇各6 ml，以及40%和50%碘克沙醇各4 ml。在4℃下扩散过夜后，将8-9 ml粗过氧化物酶体在顶部分层，并在65,000 gav下离心1小时。通过这一程序产生的过氧化物酶体用于物理、膜转运和脂肪酸结合蛋白研究。在最近的一篇论文中，离心条件是100,000 g 90min。
4. 请注意，使用垂直转子对细胞器隔离具有显著优势。这种转子较短的沉降路径长度，与摆斗或固定角度的转子相比，允许使用更低的g-力和更短的时间。这也意味着脆弱的细胞器暴露在更低的静水压力下。
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