【Serumwerk】哺乳动物和非哺乳动物HDL、LDL和VLDL的分析
哺乳动物和非哺乳动物HDL、LDL和VLDL的分析不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. Hepes-缓冲盐水：0.85%（w/v）氯化钠，10 mM Hepes-NaOH，pH 7.4
试验方法
1.使用新鲜抽取的血液(1 mM EDTA作为抗凝剂)，将细胞颗粒置于2000 g中15分钟。
2. 通过100,000 g离心10 min从血浆中去除乳糜微粒。
3.将4体积血浆与1体积OptiPrep™(12%碘克沙醇终浓度)混合，并将2.8 ml转移至OptiSeal™管。
4. 将溶液B铺在顶部以填充管。
5. 在封管后，以约350,000 gav离心2.5-3小时，在16°C，使用缓慢加速到2000 rpm和减速。
6. 以0.1 - 0.2 ml为单位穿刺收集梯度并分析。
方法注释
1．在接近垂直转子的TLN100中，2-3小时后获得的梯度密度曲线对大多数脂蛋白分离最有用，但包含浅中位截面的s形曲线(1小时后获得)可能适合脂蛋白亚分，只要这有足够的时间使脂蛋白达到它们的条带密度。
2．柠檬酸盐也可用作抗凝剂;肝素尚未进行测试。血清可代替血浆。
3．用于悬浮乳糜微粒的条件变化很大，这里使用的较短时间的高重力是非常有效的。
4．其他浓度的碘克沙醇可能适用于特定脂蛋白的纯化和来自其他物种的血浆。
5．样品上方的生理盐水不仅方便地充满了试管;它使VLDL粘附于管壁的倾向最小化。这对于垂直转子来说尤其重要。它还增强了VLDL与所有转子中最轻的LDL的分离。
6．在垂直的转子中，加入小体积的20%碘克沙醇(约0.5 ml)作为缓冲液，以防止可溶性蛋白沉积到管的外部，可能也是有益的。在近垂直或固定角度的转子中，这一点不太重要。
7．与向上移位相比，Optiseal管穿刺通常能更好地恢复VLDL。另一方面，如果使用试管穿刺，位于试管底部的血浆蛋白会更严重地污染高密度脂蛋白组分。
8．从碘克沙醇梯度分离的部分可以直接通过琼脂糖凝胶和SDS-PAGE电泳分析，并且不需要透析培养基即可分析胆固醇和三酰甘油。碘克沙醇是非离子型的，不干扰任何这些分析程序。
9．LDL特别是HDL的条带密度低于盐梯度。在碘克沙醇梯度中，载脂蛋白保留任何结合水。在高渗盐梯度中，这种水会流失。
10．该方法不仅对主要种类的脂蛋白具有良好的分辨率，而且还能产生显著浓度的脂蛋白。从每个组分中取3µl直接作用于商品化琼脂糖凝胶，电泳后用苏丹黑染色。
11．如果在VTi65.1垂直转子的管道中进行分离，该管道的高格式促进了卸载过程中梯度的分辨能力的维持。
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