【Serumwerk】蛋白质复合物的形成、微管和细胞骨架的分析（二）

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Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

蛋白质复合物的形成、微管和细胞骨架的分析不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

细胞骨架（Cytoskeleton）分析

用0.25 M蔗糖稀释OptiPrep，10 mM TrisHCl, pH 8.0, 250000 g离心3h制备的10- 40% (w/v)碘克沙醇梯度溶液可以有效分离果蝇提取物中的质膜和细胞骨架。它提供了突触融合蛋白1A(质膜标记)和密集肌球蛋白II重链(细胞骨架标记)的非常清晰的分离。

广泛使用的不连续沉降速度梯度最初是由Majoul等人设计的，包括2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%和30% (w/v)碘克沙醇，Chen等人使用65,000 g (1 h)的小鼠脊髓匀浆的核后上清液研究细胞骨架结构。梯度在4℃下扩散3 ~ 4 h，然后加载，17万g离心90 min。肌动蛋白和微管蛋白均呈双相分布，主要集中在梯度的上1 / 4处，但也在梯度的下3 / 4处出现一个尖锐的条带。缺乏一种被称为“细胞黏附修饰因子”(MOCA)的早老素结合蛋白的小鼠缺乏尖锐的致密带。用双梯度策略从培养的神经细胞中分离出丝切蛋白-肌动蛋白棒。所有步骤均在4℃下实施。将低速上清液以10%和15% (w/v)碘克沙醇分层，并以6,650 g离心10 min，使棒在两个碘克沙醇层之间的界面上方条带化。将收集的部分用13%碘克沙醇(体积比约为0.4:1.7)稀释，并在166,000 g下离心2 h以创建自生成梯度——小体积的垂直转子最适合于自生成梯度的形成。杆带接近梯度的底部。一旦回收，馏分中的棒(用等体积的缓冲液稀释后)可以浓缩在5000 g的25%碘克沙醇缓冲液中15 min。肌动蛋白棒也在双层梯度(10%和15% v/v OptiPrep，6,600 g离心10 min上进行了分析。

血管扩张剂刺激磷蛋白(VASP)的磷酸化控制了其对factin相关过程的影响，Lin等在盘骨网中研究了它们。5%、10%、15%和20% (w/v)碘克沙醇的不连续梯度约150,000 g离心18 h。WASP分布在梯度的下半部分，但在VASP存在时，WASP分布明显向更高的密度偏移。

朊蛋白和原纤维分离

（Prion protein and the protofibrils）

Tixador等人将小鼠脑匀浆中的蛋白质溶解于十二烷基- d -麦芽苷和n -月桂基肌氨酸的缓冲溶液中。将材料分层放置在连续的10- 25% (w/v)碘克沙醇梯度(4.8 ml总体积)上，并离心285,000 g 45分钟。宿主编码的朊蛋白(PrPC)在梯度的顶部出现条带，而多聚体错误折叠构象PrPSc在梯度的中间出现条带。不连续的碘克沙醇梯度也被用作从小鼠脑纯化朊病毒原纤维的过程的一部分。含有肌基的10-54% (w/v)碘克沙醇梯度(200,000 g作用1 h)也被用于测定含有朊蛋白的聚集物的大小。

Laferriè等人利用沉降速度和平衡碘克沙醇密度梯度对朊蛋白的四级结构进行了广泛的研究。小鼠脑匀浆溶解于含有EDTA, DTT，十二烷基- d -麦芽苷和n -月桂基肌氨酸的缓冲盐水中。

●对于沉降速度分析，样品在连续的10-25%碘克沙醇梯度上分层，在285 000 g离心45分钟。在一些研究中，时间增加到90分钟;这为蛋白质提供了额外的分辨率。快速和慢速沉淀绵羊品系被鉴定

●对于平衡梯度，将样品调整为40%碘克沙醇并使其成为跨越范围10-60%碘克沙醇的不连续梯度的一部分并在115,000 g下离心17小时。

●Coleman等使用了类似的沉降速度梯度(5-25%碘克沙醇)来鉴定小的可溶性蛋白酶敏感性朊病毒蛋白是小鼠脑内感染的主要来源。

●Wenborn等人通过17.5% (w/v)碘克沙醇16,100 g的过滤和一系列离心相结合，能够从缺乏铁蛋白和其他污染蛋白的脑匀浆中纯化朊病毒蛋白。

● Herrmann等使用10-40%和2-20%碘克沙醇梯度(52,000 rpm, 90分钟)来显示在药物治疗期间较大分子量的朊蛋白(来自小鼠脑)的枯竭。

●在7-28%的OptiPrepTM梯度(18,000 g 20 min)中对萨科奇溶解的脑材料进行了分析，并且在15%的OptiPrepTM中在18,000 g下进行了30 min的溶解度测定。

●最近，我们对150 μl的萨科奇溶解组分进行了沉降速度分析，这些组分装载在4.8 ml 10-30%碘克沙醇梯度上，在285,000 g离心45 min。

果蝇蛋白质类与脂质蛋白的关联

Eugster首先报道了这种方法:将幼虫的匀浆在120,000 g浓度下离心，将上清液调整为调整为50% (w/v)碘克沙醇，并在10%-20% - 35%-45% (w/v)碘克沙醇梯度下分层。4℃，285,000 g，在2.2 ml管体积的摇桶转子中离心16 h。没有明显的理由说明这种分离不能扩大。不与脂质脂蛋白结合的蛋白质保持在梯度的底部，而与脂质脂蛋白结合的蛋白质漂浮到梯度的上半部分。用此方法研究了脂质转运蛋白通过硫酸乙酰肝素与各种形态因子的相互作用。Palm等也使用了类似的梯度来研究脂质转运蛋白的相互作用。

肝炎和疱疹病毒蛋白质类分离

（Hepatitis and herpesvirus proteins）

为了从利什曼原虫细胞中分离出乙型肝炎表面抗原(sHBsAg)颗粒，后者在含洗剂的缓冲液中超声，并通过8000 rpm的离心澄清，35分钟。在颗粒形成后(16-24小时)，上清液在OptiPrep的6%，12%，18%，24%和30% (v/v)梯度上分层，在4℃ 以27000 rpm离心16小时。丙型肝炎亚单位E1和E2通过10-50%碘克沙醇的沉降速度或浮力密度梯度进行分析，碘克沙醇以160,000 gav离心16 h。在77,000 gav离心3h下，以5、10、20、30、40和50% (w/v)碘克沙醇梯度分析疱疹病毒8、白细胞介素6蛋白复合物。

其他最近的应用程序

碘克沙醇梯度也被用于研究由生物钟周期复合体形成的复合物的大小，Lin等使用20%，15%，10%，5%的小体积梯度，在约150,000 gav 4℃离心18小时，能够证明来自盘骨的VASP和GST-WASP蛋白的关联。在离心后约3小时内梯度将是连续的。

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