【Serumwerk】哺乳动物细胞外泌体和其他微囊泡（Exosomes and other microvesicles）分离

为了尽量减少表达到培养基中的外泌体的污染，外泌体通常(但并非总是)在与细胞单层接触之前，以约100,000 g离心1 ~ 16 h和/或过滤(通常为0.2 ~ 0.22 μm过滤器)以去除任何颗粒材料。有时只是胎牛血清，作为培养基的补充，使用相同的超速离心和/或过滤被澄清。偶尔使用无血清培养基。

一旦培养基与细胞单层接触了所需的时间，收获条件培养基(CM)，然后进行各种澄清，部分纯化和/或浓缩，然后进行碘克沙醇梯度纯化。

速离心法（低速、高速）

有时使用单次低速离心去除细胞和其他大颗粒，如凋亡小体，如1000-2000 g 10 min；在通过超速离心法最终回收外泌体(和其他微粒)之前，通常使用更广泛的差速离心法。尽管删除第一次低速离心可能很有吸引力，但不包括这一步骤可能会导致小囊泡被捕获并损失为在较高的重力下快速沉降的较大颗粒的聚集体。

●微囊泡也已从人血浆中分离出来，并已被鉴定为细胞间mirna转运的因子。血浆按照类似的300 g、1200 g和10,000 g差速离心步骤处理

过滤

去除较大的污染物通常使用0.20或0.22 μm注射器过滤器，偶尔使用0.1μm或0.45μm过滤器。过滤可在前进行，或更频繁地在第一次低速离心后进行;或偶尔在第二次高速离心后。偶尔过滤是唯一的梯度前处理。

外泌体和其他囊泡的浓度

几乎所有已发表的方法都涉及将100 ~ 150,000 g的外泌体和其他微囊泡最终制成颗粒，持续1 ~ 2小时，然后在合适的缓冲培养基中重新悬浮，以应用于碘克沙醇梯度。使用这些g-力的例外是使用20,000 g的肌肉细胞微粒和维外体的方法。

●Duelli等人使CM最初以500 g离心并过滤，然后以12,000 g、70,000 g和110,000 g依次离心。在差速离心组分中，外泌体融合活性在70,000 g的颗粒中高度集中，在110,000 g的颗粒中很少，并且在碘克沙醇密度梯度中进一步纯化的是前者。

一些方案，特别是那些适用于大体积CM的方案，包括使用离心超滤进行初步浓缩，以减少最终造粒(100 ~ 150,000 g)之前的总体积。这就方便地避免了大体积超速离心转子的使用。这些超滤器的临界值从5 kDa到100 kDa。

 蔗糖梯度

作为碘克沙醇前梯度纯化和浓缩程序的一部分，有时包括不连续的蔗糖梯度。Choi等在结肠癌细胞的外泌体研究中研究了多层双层蔗糖密度梯度和碘克沙醇梯度分离相结合的方法。10万g离心4 h后，外泌体集中在0.8和2.7 M蔗糖层的界面。来自间充质干细胞的微囊泡在10万g离心2 h后集中在相同的两层梯度界面。

梯度溶液制备

A. OptiPrep™

B. 0.85% (w/v) NaCl, 60 mM HEPES (or Tricine) -NaOH, pH 7.4

C. 0.85% (w/v) NaCl, 10 mM HEPES (or Tricine) -NaOH, pH 7.4

当OptiPrep™用等渗溶液(如缓冲盐水)稀释时，从这种溶液产生的梯度将对碘克沙醇产生正梯度，对所有稀释剂成分产生负梯度。如果认为保持缓冲液成分恒定是有利的，则配制溶液B和C。用1体积的溶液B稀释5体积的OptiPrep™，产生含10 mM缓冲液(ρ = 1.268 g/ ml)的50% (w/v)碘克沙醇的工作原液。

同样的策略可应用于其他等渗介质，如典型的均质介质，如0.25 M蔗糖，EDTA, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7.4。溶液B和C的处理方法与NaCl基介质相同;EDTA和缓冲液的浓度在所有溶液中保持恒定。另一种方法中，6% (w/v)碘克沙醇溶液由215 mM蔗糖组成，65.4% (w/v)碘克沙醇溶液由5 mM蔗糖组成，两种溶液均含有2 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)。

粗囊泡部分和OptiPrep™的稀释剂通常是细胞缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水，偶尔补充2.5 mM MgCl₂。与磷酸盐缓冲液不同，生理盐水可能含有有机缓冲液，如20mm HEPES-NaOH, pH 7.2。用0.25 M蔗糖，10 mM Tris-HCl pH 7.5稀释也很常见。在某些情况下，外泌体悬浮在一种简单的缓冲液中，例如20mm HEPES-NaOH, pH值7.4。使用100 mM KCl和2 mM MgCl₂的20 mM hepes缓冲溶液，在自生成梯度方法的情况下，通过使用OptiPrep™调整粗制外泌体悬浮液的密度来简单地制备层。

顶部负荷沉积速度（短自旋）梯度中的净化和分析

Dettenhoffer和Yu建立了碘克沙醇沉降速率梯度纯化HIV-1病毒而不影响病毒的感染性。作者指出，在浮力密度蔗糖梯度中，细胞外Vif基因总是与病毒共纯化，后者也被细胞来源的微囊泡污染。另一方面，在速率区碘克沙醇梯度中，HIV-1能有效地从Vif和微囊泡中分离。关于蔗糖梯度的另一个重要问题是，尽管蔗糖对病毒感染性的危害通常比CsCl小，但它仍可能对病毒结构产生严重影响。特别是逆转录病毒表面糖蛋白的丢失已被注意到。这可能与它的粘度远高于碘克沙醇有关。表面糖蛋白的丧失可能不限于病毒;膜结合囊泡可能发生类似损失是可行的。

最初由Dettenhoffer和Yu开发的用于纯化HIV颗粒的沉降速度梯度，包含6-18% (w/v)的碘克沙醇梯度，通常在12- 13ml的摇摆桶转子(如Beckman SW41)中运行。它是由多个解构造的一个不连续梯度;从步骤到步骤的浓度间隔仅为1.2% (w/v)碘克沙醇。

●由于Dettenhoffer和Yu梯度的步骤之间的碘克沙醇浓度间隔小，并且每个步骤的体积小，因此在制备和运行期间，梯度极有可能迅速变得或多或少地连续。因此，一种更容易的梯度制备方案可能是在开始时创建连续的6-18% (w/v)碘克沙醇。

在短旋转、底部负载梯度中的净化和分析

虽然梯度都是连续的(或接近连续的)顶部加载梯度，但在离心2-3小时的情况下，这一节中的梯度都是不连续的。由于它们都是底部加载，因此分离很可能是基于密度，但不能排除浮选速率的影响。5和20% (w/v)碘克沙醇的双层梯度是一种常见格式，通过将粗样品调整为30% (w/v)碘克沙醇并在200,000 g下离心使其处于层下。

浮力密度梯度中的净化与分析

其中一些长自旋(16-21小时)梯度被设置为预先形成的连续梯度。底部装载的优点是任何残留的可溶性蛋白质将保持在梯度的底部。如果梯度是顶部负载的，可溶性蛋白质将以与其分子质量成比例的速率通过梯度。重力一般在100-150,000g，但也可能高达200,000g。

自生成密度梯度的纯化与分析

最终的变化依赖于碘克沙醇在垂直(或接近垂直的转子)中形成自生成梯度的能力。使用自生成梯度的一个优点是可以简单地将样品调整到单一碘克沙醇浓度(例如20% w/v碘克沙醇)，然后在约350,000 g离心2-3小时。通过这种方法产生的梯度通常不是完全线性的，但使用这种梯度有三个大的优点:

●梯度剖面是非常可复制的

● 管道设置非常简单

●起始溶液中的颗粒非常稀，在它们的沉降或浮选期间(与底部或顶部装载相比)不会遇到任何界面:因此颗粒之间的聚集是最小的。

密度势垒

偶尔使用简单的密度屏障来浓缩外泌体可能就足够了，而不需要使用更复杂的梯度来从其他膜结合粒子中提供额外的分辨率。Hasegawa等人将上皮细胞系条件培养基分层，分别加入2%和50% (w/v)碘克沙醇，并在100,000 g离心1小时。可溶性蛋白保留在样品层中，外泌体在2%-50%碘克沙醇界面处条带。

在碘克沙醇梯度中观察到的外泌体条带密度将取决于许多操作因素。在长自旋分离(15-21h)中，外泌体应达到其浮力条带密度，这可能不取决于梯度最初是顶部还是底部负载。观察到的条带密度的差异可能是使用不同细胞和组织来源的结果。在离心时间较短(1.25 ~ 3h)的情况下，外泌体可能无法达到其真正的条带密度。在碘克沙醇浓度为6-18% (w/v)的梯度溶液中尤其如此，其中外泌体主要根据其沉降速度与其他颗粒分离。其他梯度系统处于这两个极端之间，很难确定外泌体是否达到了浮力密度。摆动桶转子管的路径长度和外泌体到其条带密度的沉淀或漂浮距离也是决定颗粒是否达到梯度中的该位置的一个考虑因素。虽然自发产生的碘克沙醇梯度也需要相对较短的自旋时间，但更高的重力和垂直转子较短的沉降路径长度意味着外泌体肯定会达到其浮力密度带的位置。

●观察到的外泌体条带的条带位置和宽度将取决于囊泡的固有异质性(在大小和内容方面)以及上述所有操作变量。

● 较大的囊泡可能比较小的囊泡有更快的沉降(或浮选)率，但后者可能有更高的浮力密度。

●Cantin等注意到外泌体在8.4-12% (w/v)碘克沙醇浓度下条带，而HIV-1在15.6%;这些浓度分别相当于1.050 ~ 1.069和1.087 g/ml。也观察到与更密集的凋亡囊泡分离。蔗糖梯度无法提供如此令人满意的分辨能力，HIV条带在1.16 ~ 1.18 g/ml，而外泌体在1.13 ~ 1.21 g/ml时完全重叠病毒。

●Lenassi报道外泌体和HIV的密度分别为1.04 ~ 1.055 g/ml和1.065 ~ 1.10 g/ml。外泌体峰缺乏病毒蛋白p24，外泌体峰富含Nef。

●在梯度的顶部1/3处观察到乙酰胆碱酯酶(外泌体标记物)和底部1/3处观察到病毒囊泡的大量线性分离。

●与蔗糖梯度相比，碘克沙醇中预期的低密度条带(分别为1.03-1.08和1.13-1.18 g/ml)也被观察到。

●Duelli等人从多种细胞系的条件培养基中分离出外泌体，碘克沙醇梯度远比蔗糖梯度更有效。

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