【Serumwerk】非哺乳动物细胞和组织中纯化病毒

浏览量：71

Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

非哺乳动物细胞和组织中纯化病毒不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

藻源病毒（藻病毒科）（Algae-derived Viruses (Phycoviridae)）分离

Lawrence and Steward使用常规培养基稀释OptiPrep™制备所有碘克沙醇梯度溶液。这将维持溶液的正常渗透压。许多作者采用了这种方法。

moniruzamn等人使用25%、30%、35%和40% (w/v)碘克沙醇各2.6 ml的不连续梯度纯化了巨病毒科病毒嗜噬金球菌(金黄色葡萄球菌)(昵称为“褐tide病毒”)，将1.5 ml样本分层，并在185,000 g离心14 h。Lawrence和Steward建议使用4 ml梯度(总体积)，约1 ml样本。20万g，维持4.25小时，或在一个放大版（贝克曼SW41转子中的13毫升管）中，在大约相同的重力下持续7.25小时。作者还指出，对于大多数下游技术(除了电子显微镜)，不需要去除碘克沙醇，并且Malitsky等人观察到碘克沙醇梯度保持了病毒的形态和感染性。

Rosenwasser等人和Schatz等人使用基本相同的梯度和离心条件纯化huxley病毒。

用1% (v/v) NP-40处理小球藻草履虫病毒1(一种“巨大”病毒)，然后在50 mM Tris-HCl中沉淀和重悬，pH 7.8，然后初始加载到10-40% (w/v)蔗糖梯度上，并在48000 g下离心20分钟。将回收的条带病毒用蛋白酶K处理以去除污染蛋白，然后以48000 gav的速度离心到20-40% (w/v)的碘克沙醇梯度中，处理4h。Dunigan等报道了相同的方法，病毒的显带密度为1.178 g/ml(相当于约33% (w/v)碘二醇)。Petro等利用土面棘红细胞增多症小球藻病毒(Acanthocytosis turfacea Chlorella virus)将蔗糖梯度替换为碘克沙醇梯度，在用蛋白酶K去除外来蛋白后，对病毒进行第三轮碘克沙醇梯度离心。

原生动物（阿米巴）（Protozoa (amoeba)）分离

Faustovirus (Vermamoeba vermiformis)是一种异常致密的病毒，这可能是因为它有两个蛋白壳，而用于纯化它的碘克沙醇梯度是相应致密的：顶部负载的12 ml 40-60% (w/v)碘克沙醇梯度在100,000 g下离心24 h。该梯度有效地将完整的病毒与空病毒体分离。

奥赛病毒（Orsay virus）分离

奥赛病毒感染线虫(秀丽隐杆线虫或布里格氏隐杆线虫):它通常在三个阶段被纯化。在第一阶段，病毒在含有2-巯基乙醇和Triton X-100的缓冲盐水培养基中通过四步不连续的碘克沙醇梯度沉淀，包括15%、25%、32.5%和40% (w/v)碘克沙醇150,000 g 3 h。碘克沙醇溶液包括含有EDTA和2-巯基乙醇的常规缓冲盐水；而15%层则含有1 M NaCl。在这方面，所述方法非常类似于用于纯化由Zolotukhin等设计的重组腺相关病毒(rAAV)的方法。高盐的存在是为了尽量减少病毒与前两个界面的可溶性蛋白的聚集。虽然梯度非常相似，但离心条件相当不同:Orsay病毒为150,000 g 3小时，rAAV为350,000 g 1小时。

然后通过超滤去除收获的病毒中的碘克沙醇；用1.0% Triton X100处理的悬浮液，应用于第二个梯度(25-45% w/v碘克沙醇)，该梯度也含有EDTA和2-醇，并在150,000 gav下离心16小时。收获病毒后，将其调整为40% (w/v)碘克沙醇，并在一个接近垂直的旋翼(Beckman NVT90)中以250,000 g再次离心1.5小时。这一步利用碘克沙醇形成自生成梯度的能力。重要的是，使用近垂直或垂直转子，以形成一个有用的密度剖面梯度。可以使用一些小体积的定角转子来代替近垂直转子。

来自海洋节肢动物

白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)是海洋甲壳类动物的主要病原体;由Dantas-Lima等人从凡纳米对虾中分离得到。虾在缓冲盐水中浸渍后，从悬浮液中去除大量污染物(3000 g 20 min)，将悬浮液(60 ml)用50% (w/v)碘克沙醇的10 ml垫层覆盖，并在60000 g下离心2 h，以在界面处浓缩病毒。在移除底部7.5 ml的垫(这是最好使用注射器连接到一个长扁头金属填充套管，i.d.约1mm )。然后将剩余材料的底部5 ml回收(即2.5 ml 50%的迪克沙醇+病毒带+ 2.5 ml浸没培养基)，在5%、10%、15%和20% (w/v)碘克沙醇的不连续梯度下分层，并在80000 g离心3小时。病毒带型取决于最初收获的是组织还是血淋巴。

来自植物细胞

病毒样颗粒在植物细胞中繁殖

蓝舌病毒样颗粒(btvpp)是利用植物表达系统在本氏烟中繁殖的。收获过程包括使用20-50% (w/v)的碘克沙醇梯度，从四种溶液中各3 ml(10%增量)产生，覆盖24 ml叶片提取物，并在85,000 gmax离心3h。病毒在30-40%碘克沙醇区条带。Brillault等人使用了一个非常相似的梯度。Van Zyl等人首先将BTVLP浓缩到40%碘克沙醇垫(79,000 g 2小时)，然后在相同的离心条件下，在不连续的碘克沙醇梯度(20- 60%)上分析它。类似的梯度也被用于纯化多瘤VLPs，同样也在本氏烟叶中繁殖。

HIV病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)同样生长在本撒米亚烟(Nicotiania benthamiana)中，在10%、20%、30%、40%、50%、60% (w/v)碘克沙醇梯度上分层，21万g离心4 h。VLPs在10%-20%界面的原始位置周围条带。人乳头瘤病毒假病毒也在本氏烟杆菌中生长。首先通过低速离心(10,000 g持续15 min)去除来自植物提取物的较大颗粒，并以约30% - 50%的梯度将其浓缩于两层蔗糖中。在回收VLPs并透析去除蔗糖后，将其置于20%、33%、40%、50% (w/v)碘克沙醇梯度上分层，并在大约离心。110,000 g 4小时。VLPs在33%碘克沙醇附近条带。

红三叶草坏死花叶病毒（RCNMV）

Lockney等研究了RCNMV衣壳在递送治疗试剂时用于特定细胞靶向的潜力。衣壳用荧光肽标记，但作者对纯化过程给出的详细信息很少。通用的0-54% (w/v)碘克沙醇梯度(含20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 120 mM NaCl, 1 mM EDTA)在175,000 g离心2 h可能是一个良好的起点。荧光标记的颗粒沿着梯度向下三分之二的方向排列。可能需要调节离心时间(或速度)。

酵母逆转录转座子

Tf1逆转录转座子作为逆转录病毒活性的重要模型正在被研究。它们具有相似的结构和传播机制。Kim等使用了广泛用于纯化rAAV的不连续碘克沙醇梯度方法。在聚集成病毒样颗粒(VLPs)的密度较大的区域，我们发现了不同的Gag物种;它们与那些没有组装成这样的粒子的较轻的粒子分离得很好。VLPs中的Ty1逆转录转座子在不连续的5-50% (w/v)碘克沙醇梯度中分离，约200,000 g离心3h。

相关产品推荐