【Serumwerk】从酵母球状体中提取内质网、高尔基体、TGN、核内体和液泡的分离

A. OptiPrep™

B. 球体裂解缓冲液：0.2 M山梨醇，1 mM EDTA, 20 mM Pipes-KOH, pH 6.8

C. OptiPrep™稀释剂：0.6 M山梨醇，6 mM EDTA, 120 mM Pipes-KOH, pH 6.8

D. 碘克沙醇(50% w/v)工作液：混合5体积OptiPrep™+ 1体积溶液B

E. 间断梯度溶液：40%、30%、25%、20%、15%和10% (w/v)碘克沙醇(稀释溶液D和溶液B)

F. 连续梯度：40% (w/v)碘克沙醇(稀释溶液D加溶液B)

在0-4℃下进行所有操作。

1．使用标准程序制备球质体裂解液。

2．通过500 g离心5 min沉淀细胞碎片和细胞核。

3．通过抽吸除去上清液并以100,000 g离心20-30 min以制备总膜部分。

4．将颗粒重新悬浮于1-2 ml溶液B中。

5．在摇摆桶转子的管中，从溶液B和40% (w/v)碘克沙醇形成12 ml线性梯度(使用双腔梯度发生器或梯度Master™)或从0.5 ml 50%，1.5 ml 40%和30%，2.0 ml 25%，3 ml 20%和15%，2 ml 10%碘克沙醇形成不连续梯度。

6．将1 ml 100,000 g颗粒悬浮液置于梯度之上以填充管。

7．离心机在100-180,000 g的情况下运行16小时，允许转子从2000转/分钟开始减速，没有刹车或使用受控的慢减速程序。

8.通过导管穿刺、用致密介质向上移位或从半月板抽吸收集梯度0.5 ~ 1.0 ml。

裂解介质和梯度溶液

Shintani所用的裂解缓冲液除在溶液B中列出的试剂外，还含有50 mM的乙酸钠。另一方面，Kim等所使用的另外含有1 mM DTT和1 mM MgCl₂。还应根据需要添加蛋白酶抑制剂。

梯度溶液的制备通过稀释50% (w/v)碘克沙醇工作溶液(溶液D)进行，该溶液含有相同浓度的EDTA (1 mM)和缓冲液(20 mM管道)作为裂解缓冲液和0.1 M山梨醇。山梨醇的浓度低于溶解缓冲液，因为碘克沙醇也对溶液的渗透压有影响。为了解释裂解缓冲液中额外的成分，溶液C也可能含有其正常浓度的6倍(例如300 mM醋酸钠或6 mM DTT + 6 mM MgCl₂)。以这种方式，EDTA、缓冲液和乙酸盐或DTT + MgCl₂的浓度在梯度中保持恒定。然而，如果认为这一点不重要(甚至不需要)，则可以简单地通过使用裂解缓冲液稀释OptiPrep™来制备梯度溶液。应根据需要将蛋白酶抑制剂添加到溶液B和C中。

转子要求

该方法可以根据需要放大或缩小，以使用大或小体积转子。它可能适用于一个垂直或接近垂直的转子，在这种情况下，离心时间可以大大减少。

球体裂解

为了破坏球质体，通过过滤器挤压球质体（3 μm孔径）悬浮液；其他工人使用标准的液体剪切均质装置，如波氏或紧合的Dounce均质器或差分裂解。无论使用何种方法，其目的都必须是尽可能温和地破坏球质体，以避免破坏脆弱的细胞器，但同时也要达到至少90%的破坏。

差速离心（分离）

将500 g上清液以10000g离心10 min，如果需要，可以将大部分较大的细胞器成球。或者，如果裂解液的体积较小，则可以省略100,000 g的步长，并将整个500 g的上清液应用于梯度上。然而，在过夜离心过程中，这部分的胞质蛋白会扩散和沉积到梯度中。

梯度施工和样品分层

将样品分层在梯度顶部的另一种方法是将样品分层在密集介质中，梯度下面是通常用于哺乳动物细胞膜分离的策略，通常会产生更好的分辨率。

梯度分辨率

使用10-50%的梯度（由不连续梯度的扩散形成）来研究一种蛋白质（Apg2p）的分布，这对自噬小体的形成至关重要。Apg2p并没有精确地与任何其他已识别的标记共定位，尽管它与ER标记重叠，但一些含有Apg2p的更密集的部分缺乏ER标记。

Kim研究了细胞质物质到液泡的转运，确定了细胞质-液泡靶向(Cvt)途径。特别是使用梯度(连续0-40%碘克沙醇)来确定Cvt9的定位，Cvt9是prAPI选择性递送到液泡所需的蛋白质。Cvt9不共定位于空泡、核内体、TGN和ER;事实上，它有自己非常独特的分布模式。

Sakakibara等人通过使梯度跨度的密度范围更小，能够提高一些膜室的分辨率;梯度由16-60% (v/v) Optiprep™构建，约相当于9-36% (w/v)碘克沙醇，在顶部装载500 g上清后，以150,000 g离心16小时。梯度可以提供非常独特的空泡、内体、内质网、顺式高尔基体和线粒体带。有趣的是，野生型酵母的条带与opi3∆变异体不同。

最近Sakakibara等人使用0.2 M山梨醇，5 mM EDTA, 20 mM HEPES-KOH缓冲液(pH 7.2)产生15-60% (v/v)的OptiPrep™梯度(150,000 g 16 h)获得了液泡，核内体，内质网，线粒体和顺式高尔基体的独特轮廓。

浮选分离

Mitsui等人在(0.8%山梨醇，10 mM三乙醇胺，1 mM EDTA, pH 7.4)中悬浮球质体裂解液膜。将悬浮液调整为35% (w/v)碘克沙醇并使用连续的12-30% (w/v)碘克沙醇密度梯度覆盖并将100,000 g离心16 h。一种更容易的替代方法是首先制备梯度，然后用样品覆盖。后期的核内体和空泡成分在梯度的顶部被回收，它们从质膜中很好地分解，质膜在梯度的三分之一处达到峰值。细胞质蛋白保留在原始样本区。

较短的离心时间的方法

有使用酵母膜分析的较短时间和较低g-力两者的几个示例。梯度通常但不是唯一，跨度更小和更低的密度范围。

1．从球质体匀浆中提取的16000 g颗粒在0-25% (w/v)的碘克沙醇梯度上分离，仅14,000g离心2小时。梯度系统能够分离ER、液泡和晚期内体部分，并在细胞壁形成和蛋白质分选的研究中用于定位Bph1p到晚期内体和液泡结构。

2．Welker等人在垂直转子中使用2.25-24% (w/v)的碘克沙醇梯度，48000 g离心1.5小时。液泡、质膜、内质网、核内体、线粒体和过氧化物酶体标记物的独特但重叠的轮廓。一种主要定位于PM和内体的应激蛋白(Hsp12)。

3.类似的梯度表明Yke4p(一种锌转运蛋白)与内质网而不是高尔基相关。

4．Diaz等使用浮选梯度追踪溴病毒复制蛋白1a。将球体溶解于150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 30 mM Tris-HCl, pH 7.5中。在500 g澄清5 min后，将裂解产物调整为40% (w/v)碘克沙醇并且0.6 ml覆盖1.4 ml 30% (w/v)碘克沙醇(并用裂解缓冲液填充)。大约离心后。20万gav作用2 h后，ER漂浮至梯度顶部。缺乏1a的CAP或HEL片段的表达大大降低了ER的浮选效率。

5．Toulmay和Prinz对PM-ER接触位点的研究发现(使用或多或少相同的方法)质膜标记物Pma1p的低密度带，并观察到突触外膜样-线粒体-脂质结合蛋白(SMP)结构域将GFP从高密度转移到低密度。

自噬体（Autophagosome）

Yamamoto在一个非常浅的梯度上解析自噬体。将澄清的裂解产物分层到4.5-18% (w/v)碘克沙醇梯度上并且在200,000 g下离心1 hr。高尔基体膜在顶部两部分中呈明显带状;核内体主要分布在组分1-7中，而自噬体主要分布在组分8-10中。最近，这些粒子也在上文第4部分所述的长自旋梯度中被鉴定：将0-30% (w/v)碘克沙醇梯度在100,000 g下离心20 h。

自生成梯度

在对囊泡形成膜的研究中，将10,000 g的颗粒悬浮在1 ml 35% (w/v)的碘克沙醇中，并在等体积的30% (w/v)碘克沙醇下分层，顶部有1 ml裂解缓冲液，在用于Beckman TLA 100.3转子的管中。将样品在约浓度离心。15万克18小时。形成的梯度部分是通过扩散，部分是通过自生。

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