【Serumwerk】噬菌体（Bacteriophage）纯化和分析

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Serumwerk Bernburg AG

Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

噬菌体纯化和分析不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

含脂噬菌体PM2（Lipid-containing phage PM2）纯化

溶液制备

A. OptiPrep™(60%含碘克沙醇)

B. OptiPrep™稀释剂:100 mM NaCl, 30 mM CaCl₂, 120 mM Tris-HCl, pH 7.2

C. OptiPrep™工作液(50%碘克沙醇):5体积溶液A与1体积溶液B混合。

D. PM2缓冲液：100 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 20 mM Tris HCl, pH 7.2。

试验方法

1．用溶液D稀释溶液C，制备5%和40% (w/v)碘克沙醇溶液

2．使用双腔梯度发生器或Gradient Master™在摇摆桶转子管(4-5 ml)中制作线性5-40%碘克沙醇梯度，并将病毒悬液装入顶部。

3．在20万g下在10℃下离心16 h。

4．PM2噬菌体在碘克沙醇1.16 g/ml时出现条带。根据需要收集病毒带型和处理。

方法注释

1．本文简要描述的初步纯化步骤由Kivela等人详细描述。在后续过夜碘克沙醇梯度纯化之前可使用其他策略。

2．为了避免病毒暴露于不同类型的梯度介质，可以用速率区碘克沙醇梯度代替蔗糖梯度。Dettenhoffer和Yu使用6- 18%碘克沙醇梯度25万g离心1.5 h来纯化HIV-1。

3．如果这两种设备均不可用，则通过允许不连续梯度(5%、17%、28%、40%碘克沙醇)扩散来创建连续梯度。

4．值得注意的是，任何附加的纯化步骤，如HPLC，微生物的再感染和许多分析技术可以直接在梯度组分上进行，而不需要去除梯度培养基，因为碘克沙醇是非离子型的，并且非常“粒子友好”。

噬菌体DSSE3Φ2和EE36Φ1和来自海洋玫瑰杆菌的病毒样颗粒分离

（Phages DSSE3Φ2 and EE36Φ1 and virus-like particles from Marine Roseobacters）

Zhao等用聚乙二醇沉淀法从澄清培养的玫瑰杆菌细胞裂解物中浓缩噬菌体;在培养基中重新悬浮后，将它们装载到10- 50% (w/v)碘克沙醇梯度上。用于纯化DSSE3Φ2和EE36Φ1噬菌体的梯度在20万g离心2 h ;用于检测诱导的病毒样颗粒的梯度离心一半的时间。用碘克沙醇梯度纯化玫瑰杆菌噬菌体用于DNA分析和基因组测序。

噬菌体KPP12（Phage KPP12）分离

该方法是由Fukuda等开发的。从铜绿假单胞菌中分离噬菌体，裂解后用PEG沉淀噬菌体。用生理盐水稀释OptiPrep™，产生30%、35%和40% (w/v)碘克沙醇梯度溶液，并将粗噬菌体悬液分层置于由三种溶液形成的不连续梯度之上。20万g离心2 h后，噬菌体在梯度上显带，等渗梯度的密度范围约为1.16—1.22 g / ml；CsCl梯度在1.3-1.7 g/ml范围内是相似的显带所需的。这凸显了碘克沙醇相对于氯化铯的巨大优势;后者的溶液不仅有毒，而且具有高渗性，在进一步分析之前，透析是必不可少的。Fukuda等发现在碘克沙醇梯度中分离出的材料非常稳定。

痘病毒科噬菌体C1（Poxviridae phage C1）分离

将噬菌体悬浮于0.2 M NaCl、10 mM MgSO₄、20 mM Tris HCl、pH 7.4中。将其浓缩至50% (w/v)碘克沙醇垫，然后在15-35% (w/v)碘克沙醇梯度中纯化(在同一缓冲液中)。20万g离心2 h。为了方便，可以通过浮选进行梯度纯化;病毒可与50%碘克沙醇缓冲液的部分或全部(从浓缩步骤)一起收集，然后按需要稀释到35%碘克沙醇。

古病毒（Archeaviruses）纯化

Gorlas, A.和Geslin, C.选择碘克沙醇作为首选梯度用于纯化和分析焦球菌(Pyrococcus abyssi)和热球菌(Thermococcus prieurii)，而不是常用的CsCl，因为碘克沙醇在恢复感染性方面有显著改善。噬菌体在30-45%碘克沙醇梯度中纯化，180,000 g离心6 h。

噬菌体S13‘（Bacteriophage S13’ ）

该噬菌体对金黄色葡萄球菌的感染能力为该菌引起的呼吸系统疾病提供了潜在的治疗价值。用不连续的碘克沙醇梯度(30%，35%，40% w/v碘克沙醇)在200,000 g下离心2h纯化噬菌体，然后用仅为两层的第二个梯度(30%和40%)使病毒在界面急剧条带化。

噬藻体S-EIV-1（Cyanophage S-EIV-1）

通过0.45 μm滤器过滤细菌裂解液后，将噬菌体超滤浓缩到不连续的20、30、40、50% (w/v)碘克沙醇梯度上，并在约85,000 g离心8小时，以使噬菌体结合。

噬菌体ΦM9（Bacteriophage ΦM9）

首先在20万g碘克沙醇连续梯度10-50% (w/v)碘克沙醇中纯化噬菌体2 h。收获噬菌体后将悬浮液调整为约。20% (w/v)碘克沙醇使碘克沙醇以35%和50%的不连续梯度作用，20万g离心3小时，使噬菌体在界面处达到浓度。

感染热病的病毒（Thermotagales-infecting virus）

Lossouarn等人已对深海热液生态系统细菌中出现的病毒进行了研究。尾六边形细菌在30-45% (w/v)碘克沙醇梯度(OptiPrep™用Tris缓冲的100 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 20 mM MgCl₂稀释)40,000 g中纯化5 h。文中未说明明确定义的病毒带的位置。

来自大肠杆菌的病毒样颗粒（VLPs）LPs

携带不动杆菌噬菌体AP205衣壳蛋白的VLPs在大肠杆菌中生长并在碘克沙醇梯度中纯化。将顶部负载的不连续梯度23%、29%和35% (w/v)碘克沙醇(OptiPrep™用磷酸盐缓冲盐水稀释)在30万g离心3小时(16℃)。在VLP疫苗的研究中，也纯化了不动杆菌噬菌体。

‘噬菌体T4基板复合物（the ‘phage T4 base-plate complex）

基板复合物在10-40%（w/v）碘二醇梯度（加50%缓冲）中纯化，在35000g下离心24小时。