【Serumwerk】外周血单个核细胞（PBMC）分离——碘二醇混合技术
外周血单个核细胞分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
OptiPrep™（使用前轻轻摇动）
稀释剂：0.85%（w/v）氯化钠，30 mM Tricine-NaOH，pH 7.4（仅适用于工作溶液）
Tricine缓冲盐水（TBS）：0.85%氯化钠，10 mM Tricine-NaOH，pH 7.4
试验方法
(1) 如果使用37% (w/v)的碘二醇工作溶液:将3.7体积OptiPrep™与2.3体积Solution B混合。
(2) 将全血与OptiPrep™或工作溶液(WS)轻轻但彻底地混合(反复倒置)，在合适的带帽离心管中(例如15 ml管，5-12 ml样品)。
(3) 层约0.5 ml的C溶液在上面，并在1500 g离心30分钟，在20℃。
(4) 从半月板向下收集到距细胞颗粒约1cm处的PBMC。
(5) 用两体积的缓冲盐水稀释收集的物质，250-500 g的细胞成丸5-10分钟。
方法注释
混合器基于Nycodenz的配方，使等量的血液和培养基混合在一起，以产生所需的密度。通过使用更高密度的溶液(OptiPrep™或由其制备的工作溶液)，混合后的血样体积仅分别增加12.5%或25%，因此细胞的环境更接近原始血浆的环境，更大的血容量更容易处理。
血浆密度的实际增加将取决于血液的红细胞压积和血浆密度。正常成年女性血液的红细胞压积较低，约为43%。如果PMN对PBMC的污染通常是不可接受的，则应减少OptiPrep™或WS的添加量。
如果目的是从单个核细胞中分离单核细胞，并且选择将OptiPrep™添加到血液中，而不是37%的碘醇工作溶液，用8.5%的氯化钠，10 mM Hepes-NaOH，pH为7.4（体积比为1：0.01）来提高OptiPrep™是有益的。
血液上的TBS层对分离并不重要，但它有助于从半月板上收集PBMC。
从8名健康献血者的5毫升或20毫升血液中回收的PBMCs数量显示原始血液样本的回收率为92-98%。回收率与体积无关，从四倍的血容量中回收的细胞数量约为四倍。在所有的PBMC收获中未观察到粒细胞，红细胞污染为总细胞的1-3%。
用碘二醇浮选分离的PBMC的回收率和纯度与用lymphooprep™获得的回收率和纯度几乎相同。然而，由于操作简便，混合浮选技术成为首选方法，特别是在处理大量潜在致病样品时。结果与Kaden等人比较了基于NycodenzⓇ的混合器的结果一致;这些工人发现两种技术的PBMC收成基本相同。
细胞会被血浆中的血小板污染。通过优先在低RCF (250 g, 10分钟)下将细胞制成颗粒，可以从人外周血单核细胞中去除部分血小板。细胞可以重新悬浮在生理盐水中，并重复洗涤过程。然而，任何细胞的造粒和重悬都可能对细胞造成损害，应该避免。
如果完全去除血小板很重要，PBMC应用等体积的溶液C稀释;分层于等体积的碘二醇，ρ = 1.063 g/ml， (5体积OptiPrep™+ 22体积Solution C)，在350 g下在20°C下离心15分钟。血小板在界面下方形成一个宽的带;整个液体被抽吸，PBMC颗粒在合适的介质中重悬。
如果血液必须在分馏前储存，那么值得注意的是，如果在提取后立即加入致密介质提高血液的密度，那么用密度屏障技术观察到的PBMC的回收率和纯度的损失就不那么明显了。这可能与这样一个事实有关，即一旦等离子体的密度提高，PBMC就不会停留。
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