【Serumwerk】莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus）纯化
莫洛尼鼠白血病病毒纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
病毒浓度
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 生理盐水缓冲溶液(Hepes或磷酸盐缓冲液）
试验方法
1．收集细胞上清并通过0.45μm滤器过滤。
2．将约32-33 ml上清液转移到用于摇摆桶转子的管道中，并在底层注入5 ml OptiPrep™。使用锥形管，上清液的体积可为28-29 ml，含1-2 ml OptiPrep™。
3．在4℃下以50,000 g离心1.5 h。
4．仔细抽吸除2-3 ml外的所有上清液;在锥形管中，这可以减少到1-2 ml。
5．在残留的上清液中收集带状病毒，尽可能少地去除缓冲液。
6．如果病毒悬液的密度过高而无法加载到后续梯度上，则用1体积的B溶液稀释其并在4℃ 6000 g下将病毒颗粒化24 h。
沉降速度梯度的净化
溶液制备
A. OptiPrep™
B. Phosphate-buffered盐水
C. 梯度溶液：用溶液B稀释OptiPrep™，以1.2%的步骤给出一系列密度从6到18% (w/v)碘克沙醇的溶液
试验方法
1．用每种密度溶液约1ml制备一个不连续梯度。最好的方法是先用蠕动泵将1毫升液体吸到塑料管中，然后在较密的一层上倒转液体轻轻排出。
2．将病毒悬液分层(＜2.0 ml)，并在4℃下以100,000 gav离心1小时。使用缓慢的加速和减速程序，或在3000转/分钟的减速期间关闭刹车。
3．先以低密度端向上位移收集梯度，约0.8-1.0 ml。病毒带就在梯度的中间。
浮力密度梯度中的净化
溶液制备
A. OptiPrep™
B. Phosphate-buffered盐水
C. 梯度溶液:用溶液B稀释OptiPrep™，给出10%和30% (w/v)碘克沙醇溶液(各20 ml)。
试验方法
1．使用双腔梯度发生器或Gradient Master™，分别用17 ml 10%和30%的碘克沙醇溶液在管中为摇摆桶转子准备梯度。
2．将3-4 ml浓缩病毒置于梯度上方并以100,000 g离心4 h;使用慢减速程序或在3000转/分钟的减速期间关闭刹车。
3．通过导管穿刺或抽吸从半月板收集梯度，约5.0 ml。在梯度的中间三分之一的病毒条带。
方法注释
1．最好的浓缩病毒的旋翼肯定是摇摆桶式的，而最好的试管则是贝克曼公司的锥形底的“锥状”试管。靠近其底部的管的小横截面积意味着可以使用更小的体积的缓冲，并恢复带状病毒，而不同时吸入缓冲本身，是容易的。
2．条带的替代方法是简单地将病毒在50,000 g下颗粒化1.5 h。
3．在含有病毒的液体的衬垫下，使用连接在长金属套管上的注射器当然是首选的方法。如此小体积的缓冲液与大体积的上清液叠加必然会导致混合问题。
4．Coleman等使用2.5 h。
5．允许转子减速使用慢减速程序或关闭制动低于2000转，以避免“科里奥罗斯”混合带状病毒。
6．使用注射器+长金属套管先取下坐垫可能更方便。
7．Coleman等人仅使用0.22 ml缓冲液，除去所有上清液(除最后0.22 ml外)，收集所有剩余液体(包括缓冲液)，用缓冲液稀释悬浮液2.5倍后进行24 h离心。由于使用更大体积的缓冲液更方便，试验方案中步骤4所述的方法应该可以在不移除超过0.2 ml缓冲液的情况下，轻松地从锥形管中获取带状病毒。
8．可以考虑的一种实用的替代方法是使用连续梯度而不是多步骤的不连续梯度。如果使用这种方法，则只制备6和18%的碘克沙醇。
9．如果要纯化较大体积的粗病毒，则必须使用较大体积梯度。由于这是速率分区分离，因此粗制病毒悬液的体积不应超过梯度体积的约15%。
10．使用更正常的移液管或注射器，需要大量的实践，才能形成许多小体积步骤的不连续梯度，无论使用的是叠层还是底层技术。推荐使用泵可促进这一过程。由于碘克沙醇在离心过程中会发生扩散，因此用密度最大和最轻的等体积溶液作连续梯度可能更容易。
11．如果需要在按梯度分层之前浓缩病毒，则确保病毒悬浮液的密度足够低以允许按梯度分层。
12．最近Eckwahl等使用8-22% (w/v)碘克沙醇的梯度，在88,000 g下离心1小时:病毒在约17-18%碘克沙醇下急剧条带。
13．通过导管穿刺收集梯度可能是一种有用的替代方法。
14．体积较小的转子(如贝克曼SW41Ti，管体积约13 ml)几乎可以肯定可以使用;按比例缩小梯度解决方案和样本的体积。
15．报告仅收集12.5 ml、10 ml和14.5 ml三个部分(高密度末端优先)——中间部分的病毒条带。
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