【Serumwerk】阿尔法逆转录病毒—劳斯肉瘤病毒 Alpha retrovirus-Rous sarcoma virus纯化
阿尔法逆转录病毒—劳斯肉瘤病毒纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. OptiPrep™稀释剂:300 mM NaCl, 6 mM EDTA, 60 mM HEPES-NaOH (pH 7.5)
C. 工作溶液(50%，含碘克沙醇):5体积溶液A与1体积溶液B混合
D. 工作溶液稀释剂:50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH (pH 7.5)
试验方法
1．一旦病毒从细胞中释放出来，通过低速离心(约为0.5 h)澄清悬浮液，5000 g 15分钟以去除细胞碎片。
2．如果需要，将上清液通过0.45 μm过滤器过滤。
3．配制12% (w/v)碘克沙醇溶液(1.2体积的溶液C与3.8体积的溶液D)。
4．为了浓缩病毒，使用36-39 ml摇摆桶转子管，并使用注射器和金属套管在悬浮液中加入5 ml 12%碘克沙醇。
5．80000 gav离心2.5小时。
6．在离心过程中，配制10%和40% (w/v)碘克沙醇溶液(溶液C和溶液D分别为1:4和4:1)。然后在双腔梯度发生器或Gradient Master™中使用等体积(5-6 ml)的两种碘克沙醇溶液，在用于14 ml摆动桶转子的管中形成连续梯度。
7．将病毒颗粒重新加入1-2 ml 5% (w/v)碘克沙醇(1体积的溶液C + 9体积的溶液D)中，并在10-40%碘克沙醇梯度上分层。
8．在4℃下以160,000 gav离心4小时。
9．通过向上移位、从半月板抽吸或导管穿刺的方式卸载梯度，每次0.5 ~ 1.0 ml。如果RSV形成可见条带(沿梯度向下约2/3)，可以使用注射器和金属套管将其回收。
方法注释
1．溶液的制备模式保证了NaCl、缓冲液和EDTA的浓度在整个梯度过程中保持恒定。如果认为这一点不重要，可以简单地用病毒悬液稀释OptiPrep™。任何合适的缓冲液都可用于悬浮病毒和制备梯度溶液。只要缓冲液具有低密度(约1.006 g/ml)，梯度的密度不会受到影响，则可根据操作者自身的要求定制。它可能是常规的磷酸盐缓冲盐水或细胞培养基(例如DMEM或RPMI)，根据需要添加任何添加剂。
2．较大的体积梯度是允许的(如Beckman SW28)，但需要增加时间来补偿较低的RCF。如果用垂直转子代替摇桶转子(如Beckman VTi50或VTi65.1)，则较短的沉降路径长度将允许较短的离心时间。
3．Vogt和Simon使RSV通过15%的蔗糖层沉积，在本研究方案中，这一层被对病毒更友好的碘克沙醇取代。
4．通过直接造粒或通过低密度层进行病毒浓缩可能是不可取的。由于颗粒的物理聚集、管底的高静水压力或用于重新悬浮颗粒的分散力(或所有这些问题的组合)，这一过程可能会导致一些传染性的丧失。一种有用的替代方法是将病毒沉淀到一个45% w/v碘克沙醇的小垫(2-3 ml)上，甚至是纯OptiPrep™。然而，除非用最少的缓冲量收获病毒带，否则可能必须将其稀释到无法接受的体积，以便在随后的密度梯度上装载。在这种情况下，碘克沙醇浓度必须是10% (w/v)。贝克曼“圆锥”管的使用在一定程度上克服了这个问题。此外，只要净化是基于浮力密度和沉降速度，那么样品体积就不是真正重要的。对于浮力密度条带，样品可以在梯度下交替分层，在这种情况下，来自垫层的污染是无关紧要的。
5．连续梯度可以通过允许不连续梯度(10%、20%、30%和40%碘克沙醇层)扩散来构建。
6．野生型RSV的中位密度约为1.14 g/ml。Gag衣壳(CA)缺失突变体的条带密度为1.16 g/ml，而基质(MA)缺失突变体的条带密度则低得多，为1.09 g/ml，这表明MA结构域对于HSV的正常组装是必需的，而主要同源区域(包括在CA中)则不是。在一项与受体结合位点结合的单克隆抗体研究中，也使用碘克沙醇梯度纯化劳斯肉瘤病毒。
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