【Serumwerk】对来自果蝇的细胞膜（Membranes from Drosophila）的分析（三）

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Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

细胞质蛋白和细胞膜蛋白、早期核内体（Early endosomes）、横纹肌膜、核的分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

细胞质蛋白和细胞膜蛋白

一个非常简单的从膜蛋白中分离胞质蛋白的方法包括将果蝇头部匀浆于0.25 M蔗糖，10 mM KOAc, 2 mM Mg(OAc)2,5 mM DTT, 30 mM HEPES, pH 7.4;1000 g澄清3次5 min，然后将上清液调整为30% (w/v)碘克沙醇，35万g离心1小时。所有的膜漂浮到顶部，可溶性蛋白沉淀。

早期核内体

将3000 g胚胎裂解液上清液加入100 mM KCl、0.25 M蔗糖、5 mM EDTA、10 mM Tris、pH 7.5中，以2.5-30% (w/v)碘克沙醇梯度分层，37000 g离心1 h。Rab5抗体可清晰识别早期核内体。

横纹肌膜

果蝇眼横纹肌膜的分辨取决于均质化的严重程度(在硅珠或Ultra-Turrax浸洗器存在的情况下进行往复振动)。后者产生的更小的膜片段允许Rh-1和HsSERT包含亚群的分解。

核

使用Optiprep™的简单缓冲液(1000 g作用10 min)来显带细胞核(重复两次)，主要是去除细胞质成分，但该方法也可以去除较小的颗粒，而不会因为反复造粒而造成损伤。或者，可将粗制核组分悬浮于25% (w/v)中(OptiPrep™照常稀释，使用0.25 M蔗糖、25 mM KCl、5 mM MgCl₂、20 mM Tris-Cl, pH 7.8)，并以10,000 g离心10 min制备核颗粒。去除上清液后，重复上述过程。

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