【Serumwerk】正黏病毒科（orthomyxoviridae）纯化

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Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

正黏病毒科纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

溶液制备

A.OptiPrep™(60% w/v碘克沙醇)

B.OptiPrep™稀释剂：任何合适的缓冲盐水(例如PBS)或缓冲液(例如100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4)。只要溶液是等渗的，那么OptiPrep™生产的所有碘克沙醇溶液也将是等渗的。）

试验方法

病毒体液的澄清和浓度

该病毒通常在细胞培养物(通常是MDCK细胞)中生长，尽管Chou等人使用了鸡蛋的尿囊液。最初澄清含病毒的分离物以去除细胞和较大的碎片通常在400 g和800 g之间进行5-15分钟，但有时使用更高的速度，如2600 g 5分钟或在尿囊液3000g 30分钟的情况下。

病毒在梯度纯化前通常(但不总是)是浓缩的。有时将病毒以大约20% (w/v)的蔗糖缓冲液制成颗粒。100,000 g作用2h或14% (w/v)碘克沙醇缓冲液作用1h (55,000 g或88,000 g)。蔗糖垫层所需的高g力和时间反映了该介质的高粘度。由于病毒最终在碘克沙醇梯度中纯化，因此使用相同的缓冲介质对病毒的压力可能较小。

梯度净化

连续的碘克沙醇梯度常用于最后的纯化步骤。使用以下条件：10-30% (w/v)碘克沙醇约100-120,000 g作用3 h， 14-26% (w/v) 55,000 g作用45 min和通过10-26% (w/v)碘克沙醇55,000 g作用45 min的两次连续梯度离心。在后两个例子中使用的短时间和低g力可能表明，对该病毒和其他病毒所报道的更高的g力和更长的时间可能是不必要的。最近Hutchinson等人使用10-40% (w/v)碘克沙醇浓度梯度通过10%碘克沙醇垫。Thompson等在350,000 g的25.5-40% (w/v)碘克沙醇梯度分割前将样品调整为20% (w/v)碘克沙醇6h。样品层的提高密度将使梯度界面上的任何聚集最小化。

不连续梯度的10%，15%，20%，25%和30% (w/v)碘克沙醇，100,000 g 3小时也被使用；15/20边界处条带的病毒纯度最高，但相邻两边界处均有病毒存在。

Shaw等人比较了流感病毒在蔗糖梯度和碘克沙醇梯度中的显带。首先使用30-60%的蔗糖梯度，覆盖1.12 ~ 1.28 g/ml的密度范围来显带病毒；碘克沙醇浓度梯度范围为1.058 ~ 1.16 g/ml。这反映出与高渗蔗糖梯度相比，在等渗碘克沙醇梯度中病毒密度较低。后者的病毒密度中位数约为1.20 g/ml，而碘克沙醇约为1.14 g/ml。蔗糖梯度高渗透性的另一个严重后果是，所有渗透性活性颗粒(如膜囊)在通过梯度时也会失去水分并接近极限密度。所以蔗糖梯度无法从外泌体的MHC-1标记中分辨出病毒的CD9蛋白；而后者在碘克沙醇梯度中的密度(约1.10 g/ml)远低于病毒。LeBouder等人也使用Latham和Galarza描述的针对病毒样颗粒的梯度用于流感病毒(80,000 g下2h)。还使用了在垂直转子中以350,000 g离心6 h的自生成碘克沙醇梯度(起始浓度18% (w/v)碘克沙醇)。

病毒样颗粒（VLP）

从澄清的培养基中造粒后，VLPs以200,000 g造粒，并加载到14-60% (w/v)碘克沙醇梯度上，以200,000g离心3.5小时。Sulli等人使用了较浅的10-30% (w/v)碘克沙醇梯度。Chlanda等使用相同的梯度，在初始浓度20万g离心2小时后，通过30%蔗糖垫粒。

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