【Serumwerk】过氧化物酶体（Peroxisome）纯化——从酵母球质体中分离过氧化物酶体
过氧化物酶体纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. 球质体洗涤液:1.2 M山梨醇，20 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4
B. 球质体裂解缓冲液:0.6 M山梨醇，1 mM EDTA, 1 mM KCl, 0.1% (v/v)乙醇，5 mM MES-NaOH pH 6.0
C. OptiPrep™
D. OptiPrep™稀释液:18% (w/v)蔗糖，3 mM EDTA, 3 mM KCl, 0.3%乙醇，15 mM MES NaOH, pH 6.0
E. 梯度稀释剂:18% (w/v)蔗糖，1 mM EDTA, 1 mM KCl, 0.1%乙醇，5 mM MES NaOH, pH 6.0
根据需要将蛋白酶抑制剂添加到溶液中。
梯度溶液的制备
将2体积OptiPrep™与1体积溶液D混合，生成40%（w/v）碘二醇原溶液，然后用溶液E进一步稀释，生成2.25%和24%（w/v）碘二醇溶液。
试验方法
在0-4℃下执行所有操作
1．从1升酵母培养物中制备球体，在YPD培养基(OD600 = 0.5-1.0)中生长。
2．将球体悬浮于溶液A (10-15 ml)中。
3．在8×50 ml固定角度转子(高速离心机)4000 g离心5分钟。
4．取出上清液，重复步骤1和2。
5．将球体悬浮于35 ml溶液B中，并在紧密配合的Dounce均质器(惠顿a型)中使用杵上下敲击10下进行均质。
6．以1,500 g将匀浆离心10 min。
7．使用注射器和金属套管抽吸并将上清液保留在冰上。
8．将颗粒重新悬浮于35 ml溶液B中，重复步骤5-7。
9．合并两种上清并以25,000 g离心30 min。
10．用小体积松装(惠顿B型)Dounce匀浆机的舂槌轻轻敲打10下，将轻的线粒体颗粒重新悬浮在6 ml溶液B中。
11．使用双腔梯度发生器或Gradient Master™从等体积的2.25和24% (w/v)碘克沙醇中制备30 ml线性梯度，用于垂直转子。
12．在梯度层中加入1.0 ml或0.5 ml OptiPrep™。
13．将样品层放在梯度的顶部，填充管并密封。
14．40000 g离心90分钟。使用受控的加速和减速程序，以确保梯度平稳的重新定位。如果这些都是不可用的，关闭刹车低于2000转。
15．首先将梯度密端收集在0.5 ml分馏中;接近梯度底部的过氧化物酶体带。
方法注释
1. 在梯度中，可以省略EDTA。
2. 最初梯度覆盖的密度范围较广，为15-36% (w/v)碘克沙醇，但最近2.25-24%或2.25-22.5%碘克沙醇梯度更受欢迎。不连续的碘克沙醇梯度较少出现;将轻线粒体部分调整为23.5% (w/v)碘克沙醇，超过35% (w/v)碘克沙醇分层，并在11万g离心2小时。在界面处有过氧化物酶体带。
3.在许多细胞器净化中，使用垂直转子是很常见的。转子的短沉降路径长度意味着颗粒很快达到它们的条带密度，梯度内的低静水压力保持了细胞器的完整性。允许使用较小的转子，如VTi65.1。如果没有垂直转子，可以用固定角转子或摇斗转子代替，但需要增加离心次数。
4. 金属套管(内径约0.8毫米)可从大多数外科器械供应公司获得。
5. 为了避免损坏脆弱的细胞器，只使用非常温和的敲击杵。
6. 使用核后上清液，而不是轻线粒体部分。
7. 如果这两种装置均不可用，则首先用等体积的15%、25%、30%和36% (w/v)碘克沙醇构建一个不连续梯度，并允许其扩散。
8. 对于较小的转子，按比例缩小所有体积。
9. 市面上有各种各样的密封管，但最容易使用的密封管是贝克曼Optiseal管。
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