【Serumwerk】布尼亚病毒科（Bunyaviridae）纯化

溶液制备

A. OptiPrep™

B. OptiPrep™稀释剂：0.2 M NaCl, 2 mM EDTA, 0.02 M Tris-HCl, pH 7.4

C. 工作液(30% w/v碘克沙醇)：将等体积的OptiPrep™和溶液B混合。

D. 缓冲液：0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.01 M Tris-HCl, pH 7.4

E. 根据需要在溶液B和D中加入蛋白酶抑制剂。

试验方法

1．通过在4℃3,700 g离心20 min来澄清培养基或细胞裂解物。

2．使用摇摆桶转子浓缩和部分纯化病毒，通过20% (w/v)碘克沙醇垫(稀释溶液C和溶液D)在67,000 g下沉淀2.5 h。

3．在步骤2中，用溶液D稀释溶液C，制备13%和22% (w/v)的两种碘克沙醇溶液。

4．在13 ml的摇摆桶转子管中，使用双腔梯度发生器或Gradient Master™从等体积的13%和22%碘克沙醇溶液中制备约12 ml连续梯度。

5．在溶液D中重新悬浮步骤2中的病毒颗粒，并对每个梯度施加约0.5 ml。

6．以25万g的梯度离心1.5 h。在从3000 rpm开始减速时，使用慢减速程序或关闭刹车。

7．通过从半月板抽吸，用密集的介质向上移位或导管穿刺来收集梯度，并分析分数。

方法注释

1．裂谷病毒是通过离心过滤装置的超滤浓缩，而不是通过沉积在碘克沙醇的致密垫层上浓缩。然后在10-30% (w/v)碘克沙醇梯度上纯化病毒；10%和30%碘克沙醇溶液应使用相同的稀释程序从OptiPrep™中制备，使用与上述相同的NaCl/EDTA/Tris溶液。用等体积的10%和30%碘克沙醇溶液在14 ml试管中形成梯度后，梯度顶部装载浓缩病毒，并在4℃下在210,000 g下离心1.5 h。病毒的条带接近斜坡的中间。

2．细胞内形式的病毒可以通过三轮冻融释放。

3．Novoa等将病毒通过30% (w/v)蔗糖缓冲层制成颗粒；为了维持病毒的等渗环境，30%的蔗糖被20% (w/v)碘克沙醇取代。理想的浓缩病毒的方法是沉淀在碘克沙醇的致密垫层上，而不是造粒。然而，在这种情况下，碘克沙醇在病毒悬液中的浓度需要达到13% (w/v)才能加载到梯度上时，这可能就不太方便了。在回收病毒带时，必须尽可能少地抽吸缓冲液。

4．Novoa等人准备了9种13% - 22%碘克沙醇的溶液(1%的步骤)，在离心管中分层等体积(致密端先)，在应用下一层之前将每一层快速冷冻在干冰中。将管保持冷冻直至所需，并通过使管在室温下解冻过夜形成连续梯度。

5．可从梯度收获密度增加的病毒颗粒：I型具有环状结构(未成熟的前体)；II型是一种中间致密型(这两种都是细胞内形式)，最后是一种致密的细胞外形式，在形态上与II型不同。

6．Ariza等利用Novoa等的碘克沙醇梯度法研究了来自Bunyam wera病毒的核衣壳蛋白结构。Weingart等人利用裂谷热病毒首先通过20% (w/v)碘克沙醇缓冲垫(115500 g持续1小时)将病毒制成颗粒浓缩；然后将病毒悬浮于含1 mM EDTA的缓冲盐水中，然后以10、15、20、25和30% (w/v)碘克沙醇(210,000 g 1.5 h)的不连续梯度将病毒条带。

溶液制备

A. OptiPrep™

B. OptiPrep™稀释剂：任何合适的等渗透平衡盐溶液

试验方法

1．用1体积的溶液B稀释5体积的OptiPrep™，产生50% (w/v)碘克沙醇溶液。

2．在管中为摇斗转子的底层近似。用注射器和金属套管注入10 ml含2 ml 50%碘克沙醇溶液的粗制病毒悬液。

3．在4℃下以约190,000 g离心3 h。

4．使用注射器和金属套管从管的底部收集4ml液体，即垫层+带状病毒+ 2ml平衡盐溶液。

5．将悬浮液与额外1 ml的50%碘克沙醇混合，然后转移到OptiPrep™上，用于接近垂直的转子。

6．在大约350,000 gav离心5小时，并允许转子从2000到0转使用控制减速程序(超过5分钟)或在2000转时关闭制动器。

7．通过管道穿刺或任何其他方法收集梯度;病毒将带在梯度的下半部分。

方法注释

1．Huiskonen et al设计了一种替代方法，将浓缩的病毒在预先形成的连续梯度上分层，该梯度是由1.5 ml 50%、42%、35%、28%、21%、14%和7% (w/v)碘克沙醇(OptiPrep™用HEPES缓冲135 mM NaCl稀释)在4℃下在25,000 g离心15 h形成的。虽然在较短时间内使用较高的重力是可以接受的，但毫无疑问，在较长时间内使用相对较低的重力将为任何生物粒子提供最佳的分辨率；此外，在15小时的离心过程中，梯度肯定会变得连续，在25,000 g的低速下，碘克沙醇分子本身很少或没有沉降。Li等在约/ 110,000 g下使用类似梯度处理3 h。

2．最近，从不连续的碘克沙醇梯度(5%步距)产生5-25% (w/v);在每一步分层后将梯度冷冻，在最后一次冷冻后将梯度顶部装入样品并以28000 g离心1.5 h。

3．对于较大体积的病毒使用，例如贝克曼SW28用于病毒浓度步骤，NVT65用于自生成梯度并按比例放大所有体积以填充管。虽然较大容积的摇桶转子不能在190,000 g的情况下运行，但可能没有必要在步骤3中增加离心时间来条带病毒(但应该检查这一点)。

4．允许使用相同容量的垂直转子，产生的梯度或多或少相同，但应包括0.5 ml的OptiPrep™缓冲液，以防止任何致密材料到达管壁。

5．碘克沙醇终浓度为30% (w/v)。

Surtees等人在4000 g聚乙二醇中沉淀30 min后纯化哈扎拉病毒。将颗粒重悬于缓冲盐水中并转移至5-25% (w/v)碘克沙醇梯度的顶部，25万g离心2.5 h后病毒在梯度中急剧条带化。

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