【Serumwerk】塞姆利基森林病毒（Semliki Forest virus）纯化
塞姆利基森林病毒纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. OptiPrep™稀释剂:3.0 mM EDTA, 0.3 M Tris-HCl, pH 7.4
C. 悬浮液:0.1 M NaCl, 0.5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4
D. 碘克沙醇工作液:50%碘克沙醇，0.5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4；将5体积OptiPrep™与1体积溶液B混合。
预成型梯度
1．用溶液C稀释溶液D，制备5%和30% (w/v)碘克沙醇溶液。
2．从细胞中获取含有病毒的上清液。
3．通过1500 g离心20 min澄清悬浮液。
4．通过以160,000 gav将病毒悬液通过5%碘克沙醇屏障制成颗粒1 h浓缩病毒悬液。
5．使颗粒在4℃于1-2 ml溶液C中分散过夜。
6．使用双腔梯度标记器或Gradient Master™从5%和30%碘克沙醇溶液各约6ml中制备连续梯度。
7．将粗制备的病毒悬浮液(1.0-1.5 ml)分层置于梯度上方并在16万gav下在4℃下离心1.5 h。
8．以大约0.8-1.0 ml的比例，先将低密度端向上移动收集梯度。病毒在梯度底部急剧条带。
沉降速度梯度
1.如所述的工作溶液的产生确保缓冲液和EDTA浓度在整个梯度过程中保持恒定。如果溶液B也含有0.6 M的NaCl, NaCl的浓度也将是恒定的，但梯度的密集部分将是高渗的。
2．如果没有梯度制造装置，则配制5%、11%、17%、24%和30% (w/v)碘克沙醇溶液。
3．为了分离Gag粒子，Hammarstedt等人使用5-20% (w/v)碘克沙醇梯度。
4．理想的浓缩病毒的方法是沉淀在碘克沙醇的致密垫层上，而不是造粒。然而，在这种情况下，碘克沙醇在病毒悬液中的浓度需要为4% (w/v)才能加载到梯度上时，这可能就不太方便了。在回收病毒带时，必须尽可能少地抽吸缓冲液。然而，可允许在不影响纯化的情况下将梯度顶部的密度提高到7.5% (w/v)碘克沙醇。在这种情况下，不需要严格要求使用4%碘克沙醇的病毒悬液。
5．过夜播散病毒颗粒避免了重悬病毒颗粒所需的通常苛刻的剪切条件，因此可能提高传染性的保留。
6．或者从等体积的5%、11%、17%、24%和30%碘克沙醇溶液形成不连续的梯度，并允许通过扩散形成连续梯度(约为0.04)。在室温下放置5小时，或在4℃放置过夜。
7．如果通过扩散形成一个梯度，通过检查空白梯度的密度确认它是连续的。
8．如果要纯化体积较大的粗制病毒，则必须按比例使用较大的体积梯度。
9．通过导管穿刺收集梯度可能是一种有用的替代方法。
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