【Serumwerk】巢状病毒目（Nevoviridae）纯化——冠状病毒科（Coronaviridae）

溶液制备

A. OptiPrep™

B. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）

试验方法

1．将细胞在溶液B中冻融3次。

2．在4℃下3,000 g离心20 min澄清细胞裂解液。

3．用1体积的PBS将5体积的OptiPrep™稀释，制备50% (w/v)碘克沙醇溶液。

4．浓缩病毒通过沉降到50%碘克沙醇的垫上，在选定的摇摆桶转子中以50,000 g离心1.5小时。在38毫升管中使用3-4毫升缓冲液，在17毫升管中使用1-2毫升缓冲液。确保每个管中含有病毒的液体的体积是已知的，这对步骤5很重要。

5．仔细抽吸所有上清液，除了一小部分与垫子相当的体积。

6．将管中的内容物充分混合，然后将它们转移到密封管中，用于选择的近垂直转子。

7．大约350-400,000 g的离心机。在4°C下运行3.5小时，并允许转子在4000转以下使用缓慢减速程序进行减速，或在4000转以下关闭制动器。

8．从半月板抽吸，用致密介质或穿刺管向上移位，收集梯度并分析分数。根据Huang等的研究，冠状病毒的条带密度约为1.2 g/ml。

方法注释

1．PBS可由任何缓冲盐水溶液替代。

2．当OptiPrep™用PBS稀释时，最终溶液将近似等渗，但如果认为最终溶液的离子强度不够高，则将OptiPrep™与0.6体积的10 x PBS和0.4体积的水混合。

3．贝克曼“锥形”管的使用可以减少垫层的体积；对于大量含有病毒的液体，这可能很方便。

4．注意Berry去除相当于缓冲液1.5倍体积的上清液，使剩余材料混合时，碘克沙醇的最终浓度为20%；而Huang等去除相当于垫层2 / 3的体积，使残余材料混合时，碘克沙醇的终浓度为30%。在这里采用的中期方法中，将缓冲液与相同体积的上清液混合，将碘克沙醇浓度降低至25% (w/v)。这三种方法可能同样有效，但由于每一种情况下自生成梯度的密度分布不同，病毒在试管中的位置也会不同。

5．在他们的PRRSV纯化策略中，Li和Murtaugh通过两轮0.5 M蔗糖屏障沉降收集了病毒颗粒，然后将病毒悬浮在20% (w/v)碘克沙醇中，并使用自我生成的梯度，在250,000 g的较低离心速度下保持较长时间9 h。

6．相同容量的垂直转子是允许的，产生的梯度将或多或少相同，但应包括一个小的0.5 ml 40%碘克沙醇缓冲液，以防止任何致密物质到达管壁。

溶液制备

A. OptiPrep™

B. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）

试验方法

1．通过15% (w/v)碘克沙醇垫(1.5体积的OptiPrep™与4.5体积的溶液B稀释)在67,000 g下沉淀2.5 h浓缩和部分纯化病毒。

2．将病毒重新悬浮于1-2 ml PBS中。

3．将1.2体积和1体积OptiPrep™分别用4.8体积和1体积PBS稀释，制备12%和30% (w/v)碘克沙醇溶液。

4．使用双腔梯度发生器或Gradient Master™从等体积(5.5-6.0 ml)的12%和30%碘克沙醇溶液中制备线性梯度，或者从12%、18%、24%和30% (w/v)碘克沙醇中制备不连续梯度，并允许梯度扩散。

5．将1-2 ml病毒悬液分层置于梯度上并以26万g离心2.5 h。使用缓慢减速程序允许转子减速或在2000 rpm时关闭制动器。

6．首先在0.7 ml组分低密度端收集梯度，并对其进行病毒分析。

方法注释

病毒浓缩：Beniac等人以约140000 g的浓度在90分钟内将病毒浓缩。推荐的方法是在较低的g力下通过垫层长时间地打颗粒，这种方法相当温和，但最好的方法是将病毒沉淀在一个致密的垫层上。然而，后者确实对从12%碘克沙醇开始的梯度上的病毒后续分层造成了问题。

Tseng使用10-40% (w/v)碘克沙醇梯度替代SARS冠状病毒；将其在约5 ml的试管中离心。175,000 g作用16小时。用PBS稀释OptiPrep™再次配制梯度溶液。梯度最初由10、20、20和40% (w/v)碘克沙醇各1.25 ml形成，但在离心过程中，它将变得连续和或多或少线性。Tseng等人比较了转染M蛋白或M + N核衣壳蛋白的培养细胞表达的颗粒。有趣的是，M蛋白组的病毒样颗粒密度(1.13 g/ml)略低于M+N蛋白组(1.14 g/ml)。因此，梯度显示出高分辨率。人冠状病毒也在10 ~ 20%碘克沙醇浅梯度上分离，在175,000 g离心18 h。

溶液制备

A. OptiPrep™

B. 缓冲盐水:150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4

C. 梯度溶液:10%、12.5%、15%、17.5%和20% (w/v)碘克沙醇，将OptiPrep™与溶液B稀释，体积比例分别为1:5、1.25:4.75、1.5:4.5、1.75:4.25和2:4。

试验方法

1．通过在67,000 g下通过15% (w/v)碘克沙醇垫(稀释1.5体积的OptiPrep™与4.5体积的溶液B)沉淀2.5 h浓缩并部分纯化病毒。

2．在步骤1接近结束时，将10%、12.5%、15%、17.5%和20% (w/v)碘克沙醇各2.4 ml通过分层或叠加的方式制成不连续梯度。

3．将步骤1中的病毒颗粒重新悬浮于溶液B中，并在每个梯度上放置1 ml。

4．在4℃下以41,000 rpm (200,000 gav)离心2 h。

5．从半月板上抽吸，用致密介质向上移位或穿刺术收集梯度，分析分离的病毒。

方法注释

使用更适合病毒液量的转子。17ml的导管只需要1- 2ml缓冲液，38ml的导管只需要3- 4ml缓冲液。理想的浓缩病毒的方法是沉淀在碘克沙醇的致密垫层上，而不是造粒。然而，在这种情况下，碘克沙醇在病毒悬液中的浓度需要为10% (w/v)以允许在梯度上加载时，这可能不太方便。在回收病毒带时，必须尽可能少地抽吸缓冲液。

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