【Serumwerk】黄病毒科（Flaviviridae）——丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus）纯化

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Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

丙型肝炎病毒纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

溶液制备

病毒悬液

在通过3000-4000 g离心10 min和/或通过0.2或0.45 m过滤器过滤澄清含有病毒的液体后，通常需要在应用梯度之前浓缩病毒。直接从培养的悬浮液中造粒，Bartolomé等在100,000 gav下从超过10%蔗糖的血清中离心病毒颗粒17 h，也可以通过将病毒与0.25体积的40% (w/v)聚乙二醇8000在4℃ PBS中孵育过夜来从培养液中沉淀病毒。离心收集后的病毒悬浮于0.85% (w/v) NaCl、0.02%牛血清白蛋白、10 mM HEPES-NaOH、pH 7.55中;并在190,000 gav下通过离心6小时通过20% (w/v)碘克沙醇垫制成颗粒。

所需溶液

氯化钠作为渗透平衡剂

A. OptiPrep™

B. 缓冲液:120mm HEPES-NaOH, pH 7.6, 0.12% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)

C. 盐溶液:1 M NaCl

用1体积的溶液B, 0.75体积的溶液C和3.25体积的水稀释1体积的OptiPrep™，制备10% (w/v)的碘克沙醇

将4体积的OptiPrep™用1体积的溶液B, 0.3体积的溶液C和0.7体积的水稀释，制备40% (w/v)的碘克沙醇。

蔗糖作为渗透平衡剂

A. OptiPrep™

B. 稀释剂1:0.25 M蔗糖，12 mM EDTA, 60 mM Tris-HCl, pH 8.0

C. 稀释剂2:0.25 M蔗糖，2 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl 5 pH 8.0

通过将5体积的OptiPrep™与1体积的溶液A混合，制备50% (w/v)碘克沙醇。

用溶液C稀释50%碘克沙醇，得到较低浓度的碘克沙醇。

预形成梯度中沉降

试验方法

1．使用双腔梯度制造器或Gradient Master™从第3a节中描述的两种碘二醇溶液中制备约12毫升的梯度（用于约14毫升的摆动桶转子，例如14毫升管，贝克曼SW41Ti)。

2．将0.5-1.0 ml粗病毒悬液分层置于顶部，并在19,000 g下在4℃离心至少6 h。

3．通过导管穿刺或从半月板抽吸收集0.5-1.0 ml的梯度，如果病毒带足够明显，则使用注射器回收病毒。

方法注释

1．Lindenbach等人是第一个使用10-40%碘克沙醇梯度的小组，这种技术可能是应用最广泛的。虽然10 ~ 40%碘克沙醇是梯度的常见范围，但其他梯度也同样成功：10 ~ 50%、6 ~ 56%和20 ~ 50%用于净化重组杆状病毒感染的昆虫细胞释放的丙型肝炎病毒样颗粒。

2．如果没有用于创建连续梯度的机械设备，则从等体积的10%，20%，30%和40%组成一个不连续梯度。因为梯度至少离心6小时，这些不连续的梯度将在离心过程中通过扩散或多或少地成为线性(取决于梯度步骤的体积)。

3．偶有10-50%(或10-40%)碘克沙醇的不连续梯度仅用5%的步距产生。通常可使其在加载试样之前在4℃下扩散4-24 h，或可在没有任何扩散时间的情况下加载试样。有报道在90000 ~ 250000 g的g力下进行离心。此外，离心力和时间不一定与梯度的大小相关:实例为230,000 gav用于5 h (4 ml梯度)到90,000 gav用于24 h或190,000 gav用于6-16 h (12-13 ml梯度)。

预形成梯度中浮选

试验方法

1．使用缓冲液制备10%，20%，30%和40%碘克沙醇溶液；Tris缓冲的0.85% NaCl溶液。

2．在大约14ml的摇摆桶转子管中，使用连接在薄金属套管上的注射器，从每一种约3.0 ml的碘克沙醇溶液和缓冲盐水中制备梯度。

3．将病毒悬液与OptiPrep™混合，并在每个梯度下加入约1.0 ml的病毒悬液，将病毒悬液调整为约45%的碘克沙醇。

4．4℃下154,000 g离心16 h。

5．通过试管穿刺收集梯度，或者如果条带足够明确，使用注射器回收它。

方法注释

通过按比例减小所有体积，该方法可以缩小到较小体积的转子。在离心过程中，由于扩散，较小的梯度或多或少会变得连续。预先形成的连续梯度也可底部装载用于浮选分离，例如，在40%碘克沙醇中由丙型肝炎病毒下层形成8-30%碘克沙醇梯度。在这种情况下，病毒之前已经非常方便地浓缩在40%碘克沙醇缓冲液上。

自生成梯度

溶液制备

A. OptiPrep™