【Serumwerk】原病毒——小鼠细小病毒（Provirus - mouse parvovirus）纯化

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Serumwerk Bernburg AG

Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

小鼠细小病毒纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

溶液制备

A. OptiPrep™

B. 10x磷酸盐缓冲盐水，含有10 mM MgCl₂和25 mM KCl, pH 7.2

C. 5 mM EDTA, 500 mM Tris-HCl, pH 7.8

D. 0.5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7.8

试验方法

1．在EDTA-Tris中制备以下碘克沙醇梯度溶液:

15% (w/v)碘克沙醇，将15体积OptiPrep™与6体积溶液C和39体积水混合;

35% (w/v)碘克沙醇，混合35体积OptiPrep™与6体积溶液C和19体积水。

2．在PBS-Mg-K中准备以下碘克沙醇梯度溶液:

45% (w/v)碘克沙醇，混合45体积OptiPrep™与5体积溶液B和10体积水;

55% (w/v)碘克沙醇，混合55体积OptiPrep™与5体积溶液B。

3．通过三次冻融循环从溶液D中的细胞中释放病毒。

4．借由在4℃下15,000 g离心30 min澄清悬浮液。

5．从1 ml 55%，2 ml 45%，2 ml 35%和1.5 ml 15%碘克沙醇制备不连续梯度。

6．将大约6 ml澄清的病毒悬液层在梯度的顶部，根据制造商的规格填充管。

7．大约15万g在18℃下离心18小时。允许转子减速到零使用控制减速程序，或关闭制动器低于2000转。

首先在0.5-1 ml密度端提取梯度。

方法注释

1．在原始方法中，所有梯度溶液都在PBS中制备。通过在PBS, 1 mM MgCl₂, 2 mM KCl, pH 7.2和50 mM Tris-HCl (pH 8.7)， 0.5 mM EDTA中配制较浓的两种溶液，获得了后来分辨率的提高。Farr等使用了两种类型的梯度溶液，一种是在pH 7.5时，梯度溶液包括PBS, 1 mM MgCl₂, 2 mM KCl, pH 7.2 pH 7.5或50 mM MES (pH 5.5) 120 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM KCl。作者比较了在pH 5.5和pH 7.5时病毒颗粒的胰蛋白酶消化。经胰蛋白酶处理后的野生型病毒颗粒在两处pH均接近45%/55%碘克沙醇的边界。然而，一个苏氨酸取代的变异体使其在pH 7.5梯度中的条带向较低的密度偏移。Plevka等人也研究了类似的梯度。

2．较小的体积改良梯度(0 .5 ml 55%碘克沙醇，各1 ml 45%、35%、25%碘克沙醇和0.5 ml 15%碘克沙醇，分别装在5 ml试管中，例如Beckman SW50.1或SW55Ti)在140,000 gav下离心20 h。

3．Cotmore和Tattershall在含有5 mM KCl和1 mM MgCl2的PBS(在5 ml试管中)中使用类似的55% (0.75 ml)、45% (1.5 ml)、35% (1 ml)和15% (0.75 ml)碘克沙醇梯度，用于基因组脱壳的体外分析。梯度从密度较低的空颗粒中完全分解感染性病毒。研究表明，突变体表现出向较低密度分布的独特转变。

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