【Serumwerk】痘病毒科（Poxviridae）纯化
痘病毒科纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. OptiPrep™稀释剂：60 mM Tris-HCl, pH值9.0
C. 50% (w/v)碘克沙醇工作溶液：将5体积溶液A与1体积溶液B混合
D. 稀释剂：10 mM Tris-HCl, pH 9.0
E. 磷酸盐缓冲液或细胞培养基
F. 屏障(仅适用于方案B)：36% (w/v)蔗糖，存于10 mM Tris-HCl中，pH值9.0
试验方法
方法A
在4℃下执行所有操作。
1．用E溶液清洗感染细胞;在相同培养基中重新悬浮并冻融细胞。
2．用超声波将病毒从细胞中释放出来。
3．通过低速离心(约1000 g持续15 min)澄清悬浮液以去除细胞碎片。
4．为了浓缩病毒，将悬浮液转移到17 ml或39 ml的管中，用于摇摆桶转子，并用注射器和金属套管垫上2-5 ml的溶液C。
5．以80000 gav离心3小时
6．使用注射器和金属套管尽可能多地去除垫(在病毒带下方)，然后从每个梯度的2- 3ml上清液中回收病毒带。
7．如果必要，这些浓度步骤可以在5 ml摆动桶转子管中重复，使用仅1 ml 50%碘克沙醇垫，在128,000 g离心2小时。
8．在终浓度离心过程中，将溶液C与溶液D混合，制成22%和32% (w/v)碘克沙醇溶液。
9．将浓缩的病毒悬液放在等体积的两种碘二醇溶液上，以50000g离心3小时。在5 ml的试管中使用0.5-1.0 ml的病毒悬液，每种碘二醇溶液2毫升；在17 ml试管中，使用2-3毫升病毒，每种碘二醇溶液超过约7毫升。
10．从两种碘克沙醇溶液之间的界面收获纯化的病毒。
方法B
在4℃下执行所有操作。IMV的预梯度处理遵循步骤1-7。对于EEV的预梯度处理，请遵循步骤8-9。按照步骤10-13净化IMV和EEV。
1．从培养皿中刮出受感染的细胞并将其制成颗粒。600g离心10分钟。
2．将细胞悬浮于溶液D中。
3．使用Dounce匀浆器的紧密贴合杵(惠顿a型)的10-12次划动匀浆细胞，释放IMV。
4．将匀浆以1000 g离心5 min，使细胞核沉淀并仔细吸取上清液。
5．重复步骤4，使用核后上清液，以最大限度地去除细胞核。
6．通过在70000 gav下通过溶液F将病毒在17 ml管中离心30 min浓缩并部分纯化病毒。
7．去除所有上清液，将病毒颗粒悬浮于2 ml溶液D中。
8．从细胞中收获培养基并在2000 g下离心10 min。
9．在75000 g下将病毒离心30分钟并重新悬浮于2ml D溶液中。
10．将病毒悬浮液(水浴超声仪)超声1分钟。
11．将溶液C和溶液D混合，制成22%和32% (w/v)的碘克沙醇溶液，在双腔梯度发生器或gradient Master™中使用等体积(7.5 ml)的两种碘克沙醇溶液，在用于17 ml摆动桶转子的管中制成连续梯度。
12．将病毒悬液置于碘克沙醇梯度上并以75,000 gav离心45 min。
13．收集带状IMV(高密度)和/或EEV(低密度)。每个带可以使用注射器分别收集，或者通过向上移位、从半月板抽吸或通过导管穿刺(0.5-1.0 ml /次)来卸载整个梯度。
方法注释
1．任何与病毒和/或后续分析兼容的低密度溶液均可用于稀释OptiPrep™或OptiPrep™生产的工作溶液。
2．在小体积的致密垫层上叠加肯定比在大体积的含病毒液体上叠加容易得多。
3．重要的是要避免使用过多的致密垫层污染回收的浓缩病毒，因为病毒悬液随后将被分层置于22%碘克沙醇溶液之上。
4．使用界面浓缩病毒，而不是造粒，可能使不聚集的病毒悬浮液的生产更容易，也避免了通常伴随造粒而出现的传染性丧失。
5．当在第一个浓缩步骤中使用较大体积的病毒悬液时，第二轮浓缩可能更有用。
6．Sandgren等人使用16/32% (w/v)碘克沙醇的不连续梯度(140000 g作用1h)，然后，从界面收集的病毒稀释后，将其浓缩到24000 g的50%碘克沙醇缓冲液中，在14 ml的摇摆桶转子管中作用45分钟。
7．确保病毒悬液有足够低的密度，在22%碘克沙醇上分层。
8．可以使用较大体积的病毒和较小体积的梯度溶液；这需要通过回收和纯度数据来确认。
9．有多种匀浆细胞的方法。低渗溶液D会引起细胞肿胀，从而促进断裂，但这可能不是保存细胞核完整性的最佳方法。由于随后通过离心(步骤4)从匀浆中去除细胞核，这可能是一个值得进一步研究的点。
10．由于Sancho等认识到最终的碘克沙醇梯度在恢复感染性evs方面比最初的蔗糖梯度更有效，因此用碘克沙醇梯度替代蔗糖屏障可能值得考虑。由于蔗糖和碘克沙醇溶液渗透压摩尔浓度之间的巨大差异，很难预测什么可能是一个合适的溶液，但20% (w/v)的溶液可能是一个很好的起点。这需要通过回收和纯度数据来确认。
11．连续梯度可以通过允许不连续梯度(22%、25%、28%和32%碘克沙醇层)扩散来构建。
12．加载于22-32% (w/v)碘克沙醇梯度上的样品也可为MVA悬浮液。
13．密度较大的带基本上是纯IMV，而较轻的EEV带含有一些IMV污染。
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