【Serumwerk】狂犬病毒（利沙病毒）（Rabies virus (lisa virus)）纯化
狂犬病毒（利沙病毒）纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. OptiPrep™稀释剂:0.15 M NaCl, 6.0 mM EDTA, 0.3 M Tris-HCl, pH 7.4
C. 悬浮液:0.15 M NaCl, 1.0 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4
D. 碘克沙醇(50% w/v)工作溶液：5体积OptiPrep™与1体积溶液B混合
试验方法
1．用溶液C(1.2:3.8体积比)稀释溶液D，制备12% (w/v)碘克沙醇溶液。
2．以1500 g离心20 min澄清细胞上清液。
3．将澄清的细胞上清液转移到管道中，供所选的摆动桶转子使用。下层8体积的上清液，约3.5体积的12% (w/v)碘克沙醇和1体积的50% (w/v)碘克沙醇。
4．12万g离心2小时;允许转子在没有刹车的情况下从2000转减速。
5．离心快结束时，用溶液C稀释溶液D(体积比分别为2:3和4:1)，再制备两种20%和40%的碘克沙醇溶液，用两腔梯度发生器或梯度大师在17 ml的管中从两种相同体积的碘克沙醇溶液中制备13-14 ml连续梯度。
6．仔细吸取狂犬病病毒带上方的液体，在密集的碘克沙醇层上方，留下约1ml的上层。
7．使用一根薄金属套管或一段连接在2ml注射器上的窄孔特氟龙管，尽可能地取出50%碘克沙醇。
8．用剩余的12%碘克沙醇收集狂犬病毒，尽量少取剩余的50%碘克沙醇。
9．用1-2体积的溶液C稀释收获的病毒(如果需要)并且在20- 40% (w/v)碘克沙醇梯度的顶部分层以填充管并且以27,000 rpm(约90,000 gav)离心18 h。
10．从半月板抽吸，用致密介质向上移位或穿刺管收集梯度，并分析分数。在梯度的前三分之一的病毒带。当在Beckman SW28转子中使用10 ~ 40%的碘克沙醇梯度时，前8 ml的梯度可以丢弃;病毒条带在以下梯度切取的3 ~ 6 ml中最大。
方法注释
1．从OptiPrep™和溶液B的工作溶液的生产，如所述，确保缓冲液和EDTA浓度在整个梯度恒定。如果溶液B的NaCl浓度也是溶液C的6倍，那么溶液B的NaCl浓度也会是恒定的，但梯度的密集部分会非常高渗。
2．使用任何适合澄清细胞上清体积的转子。
3．该方法可以根据需要缩小到更小的体积管，也可以扩大到贝克曼SW28。
4．锥形管促进了这一过程，贝克曼公司为所有的摇斗转子制造了所谓的锥形管。这种双屏障格式实现了病毒的部分纯化和浓缩。
5．如果选择10-35%碘克沙醇梯度用于病毒纯化，则可以从浓度步骤中省略12%碘克沙醇层，并将50%碘克沙醇层减少到40%碘克沙醇。
6．对于10-35%的梯度使用体积比分别为1:4和3.5:1.5。对于10-40%的梯度，分别使用1:4和4:1。
7．如果没有梯度制作装置，则制作一个不连续的梯度(5-10%碘克沙醇步骤)，并允许通过扩散形成连续的梯度。
8．使用贝克曼锥形管有助于去除大部分致密垫层。
9．收集的病毒悬液的碘克沙醇浓度需要为20% (w/v)，以便于下一个梯度的顶部，如果选择10-35%或10-40%的碘克沙醇梯度，则需要为10%。但请注意，在步骤9中，收获的病毒可能会用小体积的缓冲液稀释。如果不能达到适当的低碘克沙醇浓度，则需要另一种浓缩方法，例如Klingen等使用的尺寸排除柱或离心超滤，例如使用带有ultrtracel PL膜(100 kDa截断)的Centricon PBHK离心Plus-20过滤器单元，用于从丙型肝炎病毒制剂中去除碘克沙醇。
10．一旦确定了病毒的条带位置，可以使用注射器获取病毒条带。
11．最近，20%、30%、40%和50% (w/v)碘克沙醇各1 ml (112,000g作用18h)构建了梯度带，用于显带病毒样颗粒，但在后来的发表中，时间缩短至6h。
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