【Serumwerk】Optiprep对膜类药物贩运的分析

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Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

Optiprep对膜类药物贩运的分析不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

在碘二醇梯度中，亚细胞膜的浮力密度按以下顺序增加：PM<早期核内体<高尔基体< 高尔基体中间室（ERGIC） <内质网（ER）。一些细胞的质膜比早期的核内体更致密。

粗糙和光滑内质网(Rough and smooth ER)在自生成梯度中的差异

将含有20%碘二醇的微粒体组分在353,000gav的垂直转子中离心2小时，可以产生两个宽波段的梯度材料。RNA只在梯度中最密集的部分被检测到，其浓度向管壁急剧增加。因此，该梯度实现了SER和RER的广泛分布，这是研究每个腔室内囊泡异质性的理想选择。该系统已用于仓鼠肝脏、人肝癌、人浆细胞瘤、兔肠细胞、兔肝和T细胞的微粒体。

高尔基体、粗糙和光滑的内质网（Golgi, rough and smooth ER）在自生成梯度中的分离

高尔基体、粗糙和光滑的内如果微粒体部分只包含在高密度层（20%碘二醇）中，高尔基体和光滑的ER将浮出负荷区，进入15%碘二醇层内形成的梯度。另一方面，粗微粒体中的任何可溶性蛋白质都会倾向于通过20%的层沉积。如果分解可溶性蛋白和膜结合蛋白是重要的，那么这样的系统可能比粗微粒体分布在整个起始溶液中的系统更可取。这里描述的方案是为大鼠肝脏或分离的大鼠肝细胞设计的，但可以扩展到（修改或不修改）到其他组织或细胞类型。高尔基体（半乳糖转移酶）和ER（NADPH细胞色素C还原酶）标记物的典型分布如图所示。前六个组分几乎完全包含高尔基膜，而光滑的ER带在梯度的中间区域。RNA（未显示）从16管增加，表明粗糙的内质网位于梯度的底部。

碘二醇线性梯度的内质网、高尔基体和质膜分析

（The ER, the Golgi apparatus, and the plasma membrane）

本应用程序中描述的方案是基于Yang等人和Zhang等人首次发表的方法。Yang等人采用线性0-26%（w/v）碘二醇梯度研究了UBC6含泛素蛋白在COS-7细胞中的定位。通过利用梯度分离内质网（ER）和高尔基体，他们确定了羧基末端锚定蛋白的跨膜结构域使其易于定位到内质网，而该结构域的调节导致该蛋白重新靶向到高尔基体。Zhang等人使用1-20%（w/v）碘二醇梯度也从转染的CHO和人胚胎肾（HEK293）细胞中分离出ER和高尔基体。结果表明，全长的早生素（PS1和PS2）位于内质网中，而N端和C端片段分布在高尔基膜上。

虽然内质网和高尔基体是这些研究中最感兴趣的膜，但梯度可能同时提供质膜的纯化。这三种类型的膜的密度通常按PM<高尔基的顺序增加。

在预先形成的碘二醇梯度中，酵母球质体膜的分离

（Saccharomyces spheroplast membranes）

碘二醇梯度可以提供一种有效的方法来分离许多亚细胞室从酵母球质体。最常见的是0-40%、0-0-5%、10-50%或10-10-55%（w/v）碘二醇，在100-180000g下离心12-16小时，通常能够将液泡、ER和TGN从更密集的细胞质-液泡运输（Cvt）囊泡中分离出来。Cvt囊泡可以在19%、25%、30%、37%和50%（w/v）不连续梯度界面上进行条带，80000g离心4h。液泡和液泡下囊泡也可以以不连续的梯度分离。

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