【Serumwerk】在小体积自生成梯度中的蛋白质分析
蛋白质分析不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 蛋白质溶液：20 mM HEPES-NaOH，pH 8.0,1 mM EDTA，1 mM二硫苏糖醇，2 mM硫酸镁和0.1% Lubrol PX。
C. 稀释剂：40 mM HEPES-NaOH，pH 8.0,2 mM EDTA，2 mM二硫苏糖醇，4 mM硫酸镁和0.2%LubrolPX。
D. 蛋白质溶液（1.0-1.2 mg/ml）
试验方法
1. 将等体积的OptiPrep™和溶液C混合，产生30% (w/v)碘克沙醇工作液。此可直接用作梯度形成溶液或根据需要用溶液B进一步稀释。
2. 将一个厚壁的开顶离心机填入30%的推荐浓度。
3. 以350,000 g离心2-3小时以自行产生梯度。
4. 允许转子从2000转/分开始减速，使用受控的减速程序，允许平稳地重新定向梯度。
5. 在0.2 ml梯度上放置小体积(10µl；50µl置于2.0 ml梯度上)。
6. 将梯度在250000 g左右离心约1小时。使用受控程序从2000 rpm加速和减速。
7. 收集梯度使用Brandel微分馏器Ô或其他适当的系统。
方法注释
1. 蛋白质溶液和稀释剂可含有任何低浓度的试剂，所述试剂将有助于蛋白质的稳定性，而不会实质性地影响其密度。一些糖蛋白可能需要稍高的碘克沙醇起始浓度。
2. Basi和Rebois使用了贝克曼TLA 120.2转子，将管体积减少到0.2 ml，但还有许多其他标准贝克曼和Sorvall转子，它们可以适应类似的体积，并将产生线性梯度曲线。较大体积的转子也能够在较高的RCFs下产生近似线性梯度。
3. 产生合适密度梯度剖面所需的离心条件将随转子类型而变化。
4. 所需的离心条件将随转子的沉降路径长度和蛋白质的大小而变化。可能需要进行一些试验来优化系统以满足操作者的要求。
5. Basi和Rebois使用Brandel全自动微分馏器对这些体积较小(0.5 ml)的梯度进行分馏。该设备使用一个精细的步进电机将一个金属圆筒推进到离心管(在0.35毫米的步骤)。梯度通过圆柱体的中央通道向上移位。在圆筒的顶部有一个t形部件，允许连续的等体积分数被排出到收集管中。它能提供低至6µl的分数。对于较大的容积梯度(约2 ml)，可以使用连接蠕动泵的窄口径油管从梯度的底部收集。
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