【Serumwerk】蛋白质复合物的形成、微管和细胞骨架的分析（一）

浏览量：92

Serumwerk Bernburg AG

Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

蛋白质复合物的形成、微管和细胞骨架的分析不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

阿尔茨海默病Aβ肽和其他神经退行性疾病相关蛋白分析

（Alzheimer's disease A β peptide and other neurodegenerative disease-related proteins）

溶液制备

A. OptiPrep™

B.OptiPrep™稀释液：为了研究β-淀粉样蛋白（Aβ）肽的寡聚化，使用的稀释剂为磷酸盐缓冲盐水（PBS），但可以使用任何与蛋白-蛋白相互作用兼容的稀释剂。根据需要在溶液中加入蛋白酶抑制剂。

试验方法

1. 在0-4℃或任何与所研究的相互作用相容的温度下进行所有操作。

2. 用PBS稀释OptiPrep™以产生下一步使用的溶液。

3. 在所选转子的管道中依次分层：0.65 ml 50%，40%和30% (w/v)碘克沙醇，1.95 ml 20%，0.65 ml 10%和0.3 ml 5% (w/v)碘克沙醇。

4. 在顶部将0.3 ml蛋白溶液分层并在0-4℃下以350,000 g离心3 h，使用超过0-2000 rpm范围的受控加速和减速。

5. 通过Maxidens™和Axis-Shield梯度收集器向上位移，管穿刺或使用Labconco Auto Densi-flowⓇ从半月板自动抽吸，以0.3-0.35 ml为单位收集梯度。

方法注释

1. 如果保持缓冲液浓度(例如20 mM Tris-HCl, pH 8.0)和低浓度其他添加剂(例如1 mM EDTA和1 mM DTT)的恒定背景是重要的;然后，将5 vol. OptiPrep™与1 vol. 6 mM EDTA, 6 mM DTT, 120 mM Tris-HCl, pH 8.0混合，制备50% (w/v)碘克沙醇工作溶液(WS)。然后通过20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM DTT, 1 mM EDTA稀释WS获得进一步稀释。所有梯度溶液都将含有所需浓度的缓冲液和添加剂。

2. 垂直或接近垂直的转子是理想的沉降速度分离，因为(a)样品层在重新定向后获得一个非常窄的区域宽度和(b)沉降路径长度短。如果使用其他转子(固定角度或摇斗)，样品体积永远不能大于梯度体积的10%，离心时间需要增加，以考虑较长的沉降路径长度(特别是在较大体积的摇斗转子)。

3.由于路径长度较短，梯度在30 min内或多或少连续。另一种方法可能是在样品分层之前在离心管中产生线性连续梯度；然而，通过使用协议步骤3中描述的非均匀层体积而实现的不规则密度分布将会丢失。

4. 如果所述方法用于研究其它蛋白质的寡聚化，则RCF或离心时间可能需要根据蛋白质颗粒的大小进行调节。

5. 图1给出了一个使用梯度系统可以实现的分辨率示例。新鲜制备的六氟-2-丙醇(HFIP)处理的-淀粉样蛋白(A)肽在35℃孵育期间发生寡聚化，在此温度孵育0 min、30 min、18 h和18 d后，通过SDS-PAGE分析该肽在梯度上的分布。肽在梯度中的位置反映了肽单体结合的程度和类型。

6. 该方法也适用于小体积的摇斗转子:Rzepecki等人使用了类似的梯度，该梯度被缩小到在Beckman TLS55 (2.2 ml管)中使用259,000 g离心4 h, Lockhart等人使用Beckman MLS50 (5 ml管)研究在268,000 g离心3 h时淀粉样原纤维的形成。导致a肽从寡聚体形式转变为更大的聚集体和a结合肽L3。

7. 最近关于寡聚化过程的研究也在或多或少相似的离心条件下使用了TLS55转子;然而，梯度略有改变;浓度梯度为50%、40%、30%碘克沙醇0.26 ml, 20%碘克沙醇0.78 ml, 10%碘克沙醇0.26 ml, 5%碘克沙醇0.1 ml。使用梯度分析Aβ(1-42)聚合体，使用100ml的样品，在顶部分层。Brener等描述的梯度系统已被用于展示单体Aβ与d -肽和GM1的优先结合。

8. Sehlin等使用了与Ward等类似的碘克沙醇梯度，除30% (w/v)碘克沙醇(1.95 ml)外，每步均为0.65 ml，省略了5%层。梯度有效地分辨了不同大小的A肽聚集体。

9. 朊病毒也已在多步骤方法中被广泛纯化。在脑匀浆的初级分离中，将后者调整为18% (w/v)碘克沙醇并分层超过30%和35%碘克沙醇。在60000 g离心20 min后，丢弃顶层脂质层，并收集较密集的两层内的材料。用缓冲液稀释后，用26%和35%碘克沙醇的第二个梯度分层，并以相同的速度离心40分钟。再次丢弃最上层，回收两个较密层中的材料，然后进一步处理。

11. 最近，一种简单的不连续浮选梯度(36%、24%和0%碘克沙醇)在54,000 g离心3小时，用于从a β中分离较低密度的ldl结合a β。

12. 碘克沙醇梯度最近被用于纯化金属纳米粒子结合的a β特异性配体，以增加结合亲和力。

非肌性肌球蛋白II (NMII)

该研究由Shutova等报道，将洗涤剂可溶性细胞裂解物按50%、25%、12%和6% OptiPrep层的不连续梯度分层。在80000 rpm离心1小时后，梯度分离出单体和丝状NMII，其沉降系数分别约为7S和16S。在blebbistin处理的细胞中，单体形式增加的程度更大。

驱动蛋白相关马达蛋白KIF1A的二聚化

Rashid等人使用3.8ml 5-40%（w/v）碘二醇，用0.2 ml样品覆盖在贝克曼SW60Ti摆动桶转子中，100,000 g，在4℃下放置16小时，以鉴定KIF1A的二聚体。

α-突触核蛋白（α-synuclein）聚集

在2.5%、25%和35%（w/v）碘二醇的不连续梯度中分析了COS7细胞中胞质α-共核蛋白更大的蛋白聚集物，仅以50000g离心30 min。

微管碎片（Microtubule debris）大小分析

MacCormick等描述了一个包含神经生长因子激活的ERK(细胞外信号调节激酶)和MEK的大蛋白复合物。分馏过程的一部分包括分离非离子型去污剂不溶性部分，该部分也含有含有一些结合激酶的微管片段。甘油梯度不能有效地溶解较大的微管碎片；然而，以下由MacCormick等人设计的碘克沙醇梯度法提供了这些粒子的良好分辨率。

1. 通过滚珠轴承匀浆器使PC12细胞通过单一通道通透。

2. 通过通透性释放细胞内物质，并通过1000 g离心10 min从残留的“细胞”中分离。

3. 通过10% (w/v)蔗糖缓冲液将上清材料在含有1 mM EGTA和1 mM Na3VO4的20 mM MOPS (pH 7.2)中造粒，以100,000 g浓缩。

4. 将颗粒悬浮于含有天冬氨酸钾、葡萄糖酸钾和谷氨酸钾(均为38 mM)、20 mM MOPS、10 mM碳酸氢钾、0.5 mM碳酸镁、1 mM EDTA、1 mM EGTA、pH 7.1的缓冲液中。

5. 在相同的缓冲液中制备30% (w/v)的碘克沙醇溶液，使用双腔梯度发生器或gradient Master连续制备0-30%碘克沙醇。如果这两种设备都不可用，则从0%、10%、20%和30% (w/v)等体积组成一个不连续的梯度，并允许在4℃下扩散过夜。

6. 将样品层在梯度上(样品体积占总梯度体积的10%)。梯度分离是一种沉降速度分离，因此其分辨能力与样品体积成反比。20万g离心1-3小时(从2000转/分钟减速期间关闭制动或使用受控减速程序)。

7. 通过导管穿刺或从半月板收集梯度。MacCormick等人收集了27次梯度。

离心1小时后，PC12细胞的微管片段根据大小被分解成4个离散的部分，由-微管蛋白分布确定，但ERK只与其中3个相关。

相关产品推荐