【Serumwerk】核酸-蛋白复合物（nucleic acid – protein complexes）分离

制备含有0.3 M KCl, 2 mM MgCl₂, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.4的溶液将是稀释5体积的OptiPrep™与1体积的1.8 M KCl, 12 mM MgCl₂,120 mM HEPES-KOH, pH 7.4，因此可达到的最高碘克沙醇浓度将是50% (w/v)。

Apcher等研究了EpsteinBarr病毒编码的EBNA-1的甘氨酸-丙氨酸重复(GAr)序列顺式抑制mRNA翻译的能力。碘克沙醇梯度(未定义)在155,000 g离心2 h后，能够识别40S核糖体、60S核糖体和80S核糖体+多聚体。

Wang分析了DDX3, HBV Pol和来自裂解的转染HEK293细胞的核心蛋白，在2 ml 10-50% (w/v)碘克沙醇梯度中，1% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4(加蛋白酶抑制剂);将梯度离心至约。20℃下200,000 gav 45分钟。每个蛋白都有不同的密度分布轮廓，DDX3蛋白在RNase a处理后向低密度偏移，碘克沙醇梯度表明正是这种蛋白被并入核衣壳。

Kim et al也使用了相同范围的小体积沉降速度梯度，同样用细胞裂解缓冲液稀释OptiPrep™，并在相同条件下离心。梯度显示，与野生型Pol不同，突变型Pol没有被纳入衣壳粒子。这一梯度表明，核衣壳的核心蛋白在梯度的2 / 3处，另一方面，Pol，虽然与核心蛋白重叠，但显示出向低密度更广泛的分布。eIF4E(真核翻译起始因子)呈双相分布，主要分布在低密度部分(可能是多体)。蛋白酶K和RNase处理导致eIF4E和Pol的低密度条带的缺失，这些条带仅在梯度的密集核质区检测到。

He等和Di Re等描述了使用碘克沙醇梯度分析线粒体核蛋白。使用低渗的含DDM的培养基裂解胰蛋白酶处理的线粒体；然后，在低速离心(1000 g 10 min)后，将裂解产物加载到20 - 45% (w/v)碘克沙醇梯度(在20 mM HEPES-NaOH pH 7.6、1mM EDTA、25mM NaCl、1mM DTT、0.1% DDM中)并在100,000 g下离心12 h。mtDNA条带在30- 32.5% (w/v)碘克沙醇，并与参与线粒体类核组织的蛋白和DzNA聚合酶γ (POLGβ)结合。最近，同一研究小组报告了-肌动蛋白、肌球蛋白和TFAM的结合。

Sharma等人使用略浅的20-42.5% (w/v)碘克沙醇梯度运行14 h。这一梯度表明，mtDNA与(a)端粒酶逆转录酶(b) PABPC5(胞质多聚a结合蛋白家族的成员)，(c)重组C4orf14相关。尽管m-RNA和mtDNA在梯度上接近，He等人在研究类核相互作用蛋白和线粒体蛋白合成时所使用的仔细分离清楚地表明，一些蛋白主要与m-RNA结合，而另一些蛋白主要与mtDNA结合。Kazak等表明复制蛋白Flap核酸内切酶1的一种亚型与mtDNA中的RNA/DNA杂交体相互作用。

10-50% (w/v)碘克沙醇在85,000 g离心15小时的梯度被用于研究生物钟负反馈中特异性m- RNA的参与。用20-42.5% (w/v)的碘克沙醇梯度(100,000 g作用14小时)分析HEK细胞中洗涤剂溶解的线粒体，结果表明PrimPol，一种DNA引物和聚合酶，从mtDNA和DNA维持蛋白中被分解。然而，去污剂裂解前的甲醛交联显示PrimPol与mtDNA的短暂交联。

Rajala等利用类似的梯度(将样本置于底部)研究了复制因子与mtDNA的关联。简单地说，纯化的线粒体在Triton X-100中溶解，有或没有用洋地黄苷对膜进行初步造粒。将材料调整为42.5% (w/v)碘克沙醇，并使用含缓冲盐水和1% T-X100的不连续0、20%和25-40%碘克沙醇梯度覆盖(以2.5%步骤进行)。mtDNA +核相关蛋白在约25-27%碘克沙醇水平条带，而较大的核糖体亚单位蛋白在约25-27%碘克沙醇水平条带。37.5%碘克沙醇10万g离心14 h。

Lee等人和Bogenhagen对mtDNA类核的研究采用了双梯度法，即先用沉降速度甘油梯度，再用浮力密度碘克沙醇梯度。简单地说，在Triton X100中溶解线粒体，并将澄清的材料加载到15-40%甘油梯度上(超过30% (w/v)碘克沙醇/20%甘油的缓冲垫)，并在210,000 g下离心4小时。23%甘油)，通过20-40% (w/v)碘克沙醇梯度，14万g离心12-14小时。在这个梯度中，mtDNA和DNA结合蛋白(TFAM)在33%碘克沙醇周围条带，而核糖体复合物在高密度低密度t-RNA DNA m-RNA在26%碘克沙醇周围条带。

Gerhold等人使用浮选策略表明，mtDNA在类核中复制所必需的解旋酶Twinkle与一个耐洗涤剂膜域相关，该膜域通过碘克沙醇梯度浮选而溶解。由含有1% Triton X-100的40、37.5、35、32.5、30、27.5、25、20和0%碘克沙醇溶液形成的不连续梯度，通过洗涤剂处理的膜样品下层分层，并在100000 g离心14 h。在离心期间，梯度将成为连续的；闪烁和DNA结合到梯度的顶部。

在一项关于Tacaribe病毒RNA复制的研究中，Baird等人开发了一种用于分析复制转录复合物(RTCs)的非常有用的碘克沙醇梯度。在含有k -天冬氨酸、k -谷氨酸和k -葡萄糖酸盐(均为38 mM)、10 mM KHCO3、2mM MgCl2(或5 mM EDTA)、2mM DTT、10M ZnCl2和20 mM MOPS pH 7.1（加蛋白酶抑制剂）的培养基中，通过Dounce匀浆或添加去污剂(2% NP40)将含病毒的细胞裂解。15-48% (w/v)碘克沙醇梯度(含有与溶解培养基相同的试剂)形成于5 ml管用于摇桶转子;使用梯度前或允许间断梯度(等体积的15%、26%、37%和48%碘克沙醇弥散)。在将样品调整为50% (w/v)碘克沙醇后，将其在连续梯度下分层并在100,000 g下离心20 h。有关梯度形成和样品底层的更多信息，请参见应用表M02。与所有的浮选梯度一样，可溶性蛋白保持在负载区，允许其他大分子和大分子复合物漂浮到梯度中。塔卡利贝病毒核蛋白的大部分条带密度证实了其与病毒膜的结合。重要的是，梯度也能够区分全长RNA(与核蛋白共带)和更密集的mRNA核蛋白。Baird等也观察到梯度可以分解其他新的RNA物种。

封装DNA的新方法可以使用碘克沙醇梯度进行纯化。

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