【Serumwerk】从蛋白质中分离蛋白质脂质体（Protein liposomes）和从脂质体中分离脂质体包裹的大分子

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Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

从蛋白质中分离蛋白质脂质体不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

溶液制备

缓冲液组成

在已发表的方法中，没有一致的梯度使用特定的缓冲液，它可以从简单的缓冲盐溶液或含1 mM EDTA的缓冲蔗糖溶液到含100 mM KCl, 10%甘油，1 mM DTT, 25 mM HEPES-KOH, pH 7.4或140 mM葡萄糖酸钾，4 mM MgCl₂, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.3的溶液。操作者应使用任何最适合于蛋白脂质体稳定性的培养基，该稳定性可随用于脂质体或并入的蛋白质的脂质类型而变化;为方便起见，本申请表中给出了简单的缓冲盐和蔗糖溶液。

溶液制备

选择溶液D或溶液E

A. OptiPrep™（使用前轻轻摇瓶）

B. OptiPrep™稀释液：200 mM HEPES-NaOH，pH 7.4（如果选择溶液E，则包括10mM EDTA）

C. 工作溶液(54% w/v碘二醇）：将9体积OptiPrep™与1体积溶液B混合

D. 脂质体缓冲液1：100 mM氯化钠，20 mM HEPES-NaOH，pH 7.4

E. 脂质体缓冲液2：0.25 M蔗糖，1 mM EDTA，20 mM HEPES-NaOH，pH 7.4

注释：54% (w/v)碘克沙醇工作溶液的制备使缓冲液和EDTA(如果选择溶液E)的浓度在梯度溶液和样品中保持恒定。如果认为其他试剂对蛋白脂质体的稳定性很重要，例如1 mM DTT或4 mM MgCl2，那么这些试剂也可以以10倍所需浓度加入溶液B中。这种溶液策略避免了如果用等体积的纯净OptiPrep简单稀释蛋白脂质体悬液，这些试剂浓度降低50%。在工作溶液中包括渗透压平衡剂、氯化钠、氯化钾、蔗糖或甘油是不正常的做法。

离心转子要求

通常使用带有或0.8- 5ml管的摆动斗转子(如贝克曼SW55Ti)。小体积贝克曼固定角转子也被用于NycodenzⓇ和碘克沙醇梯度：MLA 130,TLA100.2和TLA100.4。

梯度离心

碘二醇梯度中的浮选

在4℃下执行所有操作。

取2.4体积的蛋白脂质体混悬液与3体积的溶液C混匀，调整其密度至约1.16 g/ml。

用溶液D或E稀释溶液C，配制25%和5% (w/v)碘克沙醇溶液，体积比分别为2.5:2.9和0.5:4.9。

在用于所选转子层的管中，分别使用约1.0:2.5:0.1的体积比的蛋白脂质体悬浮液、25%碘克沙醇和5%碘克沙醇溶液。

20万g离心3小时。如果使用固定角度的转子，使用慢加速程序。

允许转子在没有刹车的情况下从2000转/分钟开始减速，或者在超速离心机上使用减速程序，并从25%/5%碘克沙醇界面获取带状蛋白脂质体。可在一系列分数中交替地卸载梯度。

其他梯度

在第5a部分给出的方案中，通常在NycodenzⓇ梯度中使用的缓冲液的顶层被5%碘克沙醇层取代。在底载梯度中，蛋白脂质体制剂中的碘克沙醇浓度通常为30% (w/v)或40% (w/v)，偶尔使用较低的浓度(24%)。梯度格式的变化是:(a) 20%和0%，24%，18%和3% ;(b)遗漏最上层，例如30%碘克沙醇的样品覆盖18%碘克沙醇，(c)通过与OptiPrep™混合并覆盖缓冲液，将样品调整为约33% (w/v)碘克沙醇或30%碘克沙醇。样品和密度层的相对体积可能不是很关键，但样品上面的层应该足够大，以使蛋白脂质体与未掺入的蛋白质充分分离。

据报道，在较大的直径下，顶部负载的5%、15%、30%、40%碘克沙醇梯度的分辨率也有所提高。14 ml管转子在150,000 g下运行18 h。分离也在固定角度的转子中在10万g下进行5 h；而如果使用小体积的TLA100.4，在500,000 g时只需要1 h。

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