【Serumwerk】对来自果蝇的细胞膜（Membranes from Drosophila）的分析（二）
脂筏（lipid rafts）的分离（作为抗洗涤剂膜）不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 洗涤液1：0.9% (w/v) NaCl, 0.1% (w/v) Triton X-100
C. 洗涤液2：0.9% (w/v) NaCl
D. 均质培养基(HM)：0.3 M蔗糖，150 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 100 mM Tris-HCl, pH 7.5
E. 三羟甲基氨基甲烷氯化钠EDTA缓冲剂（TNE）：150 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 100 mM Tris-HCl, pH 7.5
F. Optiprep™稀释缓冲液：150 mM NaCl, 1.2 mM EGTA, 100 mM Tris-HCl, pH 7.5
G. Optiprep™工作液(50%碘克沙醇)：使用1体积溶液F稀释5体积Optiprep™
试验方法
除步骤1外，所有操作均在0 ~ 4℃进行。
1．脱绒毛膜胚胎在B溶液中冲洗2次，在C溶液中冲洗3次。
2．用溶液D冲洗胚胎两次。
3．将洗涤后的胚胎悬浮于10体积的溶液D中，首先在宽松的Dounce(玻璃-玻璃)匀浆器(惠顿B型)中匀浆，然后在紧合的Dounce (惠顿a型)中匀浆。通过光学显微镜监测匀浆过程。
4．将匀浆3000 g离心10分钟以去除细胞核和碎屑。
5．通过将1体积的溶液G与4体积的溶液G混合，将3000 g上清液的碘克沙醇浓度调整为40% (w/v)碘克沙醇。
6．从溶液G和溶液D(体积比分别为3:2和1:9)中制备30%和5% (w/v)碘克沙醇溶液。
7．将3000 g上清液(在40%碘克沙醇中)均匀分布于27 ml摆动桶转子的管中，并分别将10 ml和5 ml的30%和5%碘克沙醇溶液层在顶部以填充管。
8．以100,000 g离心3 h。
9．从5%/30%碘克沙醇界面收集质膜富集部分，用3体积的溶液E稀释。
10．以50,000 g将膜制成颗粒并保持30 min。
11．抽吸上清液；将颗粒重新悬浮于溶液E中并重复步骤10。
12．将颗粒重新悬浮于0.5 ml溶液E中，并与含有2% (w/v) Triton X-100(或其他选择的2倍所需浓度的洗涤剂)的等体积溶液E混合。
13．在4℃下保持30 min以使洗涤剂敏感膜溶解。
14．在溶解过程中，将溶液G与溶液E稀释，分别以2.1:2.9、1.5:3.5和0.6:4.4的体积比制备21%、15%和6%(w/v)碘克沙醇溶液。注意，在梯度解的密度中有一些重要的已发表的变化。
15．将步骤13中的悬浮液与等体积的溶液G混合。
16．在试管中大约5 ml摇桶转子，在2 ml的样品层上分别加入1 ml 21%， 15%和5% (w/v)碘克沙醇溶液。
17．以约150,000 gav离心5-6小时。
18．允许转子在没有刹车的情况下在2000转以下减速或使用受控减速程序。
19．脂筏带作为可见层在顶部界面。通过导管穿刺、向上移位或从半月板抽吸获取该层或梯度0.25 ~ 0.5 ml。
方法注释
均质化介质
均质化培养基(HM)通常已专门用于果蝇膜的分割。在该实例中，所述溶液用Tris缓冲，但如优选，可使用Hepes、Tricine或三乙醇胺(在相同浓度下)。缓冲液的类型不太可能显著影响均质化或分馏，尽管对于哺乳动物细胞，三乙醇胺似乎在均质化效率方面提供了一些特别的优势。
HM变异包括30 mM NaCl, 5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5, 1% TX-100果蝇光感受器，150 mM NaCl, 20 mM EGTA, 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 1% TX-100果蝇神经元细胞系和果蝇头。
如所述的工作溶液(溶液G)的制备，确保EGTA的浓度在整个梯度中保持恒定。如果认为这一点不重要，则可直接从OptiPrep™制备梯度溶液。这种方法的一个优点是致密膜悬浮液(方案的步骤5和15)的最终体积较小。根据操作者的判断，蛋白酶抑制剂可包括在解决方案D-F中。
均质化
其他均质化方法也有报道;Rietveld等人在双Dounce匀浆之前使用了Potter-Elvehjem(玻璃-特氟龙)匀浆器。Zhai等人将胚胎悬浮液20倍地通过注射器的细针(27G)，在含有洗涤剂的缓冲液中直接匀浆，从而避免了第一个质膜梯度。
3000g上清液的密度的调整
如果OptiPrep™是用来调整密度，然后混合2体积的OptiPrep™与1体积的上清液。虽然减少了容积，但EGTA浓度也会降低。
脂筏梯度
碘克沙醇梯度的精确格式有相当大的变化范围:(1)样品在40%碘克沙醇中，覆盖1.2 ml 30%碘克沙醇和0.2 ml 0%碘克沙醇;(2) 40%碘克沙醇样品，覆盖30%碘克沙醇、20%碘克沙醇、5%碘克沙醇各1ml;(3) 40%碘克沙醇样品，覆盖30%碘克沙醇0.9 ml和5%碘克沙醇0.3 ml。后者在小体积的贝克曼TLS55旋翼上进行。Zhai等人也将这种格式用于体积更大的Beckman SW60旋翼中的果蝇S2细胞。
值得注意的是，通常Triton X-100(或其他洗涤剂)只包含在致密的样品层中，而Zhai等人在所有梯度溶液中都包含1%的Triton X-100。
离心
不同实验室的离心条件不同；在较高重力（例如280,000g下2小时），可以使用更长时间。
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