【Serumwerk】细菌(Bacteria)纯化（二）
细菌纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
沙门氏菌（Piscirickettsia salmonis）纯化
溶液制备
A. OptiPrep™（使用前轻轻摇动）
B. 盐缓冲液：150 mM氯化钠，12 mM氯化锰，1 mM EDTA，10 mM Tris-HCl pH 7.6
C. OptiPrep™稀释液：150 mM氯化钠，3 mM EDTA，30 mM Tris-HCl pH 7.6
D. 40%（w/v）碘二醇的工作溶液（WS）：将4体积OptiPrep™与2体积溶液C混合。
E. WS稀释剂：150 mM氯化钠，1 mM EDTA，10 mM Tris-HCl pH 7.6
试验方法
在4℃下执行所有操作(步骤5除外)
1. 用溶液E稀释溶液D，制成22%，24%和26% (w/v)碘克沙醇的三种梯度溶液，在17 ml管中从每种溶液的4.5 ml中制成不连续的梯度溶液。
2. 在室温下通过扩散使梯度变为线性1 h，然后使其变为4℃。
3.收集含菌液，200 g离心10 min，去除宿主细胞碎片。
4. 通过将200 g上清液以10,000 g离心45 min浓缩细菌。
5. 将颗粒悬浮于6 ml B溶液中，与20 U DNase I在30℃孵育1 h。
6. 借由添加0.6 ml 200 mM EDTA原液来停止反应。
7. 在每个梯度的顶部加入3 ml, 25,000 g离心3小时。然后从梯度的顶部1 / 3收获锋利的细菌带。
方法注释
1. 如果没有超离心机，所需的重力足够低，可以接受高速离心机的摆动斗转子（例如贝克曼JS24.15）。
2. 或者，可以使用双室梯度制造器或Gradient Master™进行连续梯度。
3. 沙门氏菌条带的密度约为1.13 g/ml；其他细菌可能有不同的条带密度，在某些情况下可能有必要改变梯度密度范围。来自宿主细胞的污染物细胞器密度较高。
单核细胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）纯化
此细菌在单核细胞培养的细胞内生长，并通过蒸馏水裂解从细胞中释放出来。通过60、30和20%（w/v）碘二醇在45000g下离心1小时，将细菌从细胞碎片和细胞质中纯化出来。
嗜吞噬细胞支原体（Anaplasma phagocytophilum）纯化
人早幼粒细胞系(HL-60)中生长有嗜吞噬细胞无形体。为了纯化细胞均质化释放的细菌，将粗馏分分层置于不连续的碘克沙醇梯度上，分别为30% (6 ml)， 25%， (5 ml)， 20%和3.5 ml 17.5%， 15%， 12.5% (w/v)碘克沙醇(在等渗缓冲液中)。在4℃下在87,000 g下将梯度离心74 min。细菌带在最下面的界面。
立克次氏体（Rickettsia）纯化
伤寒立克次体在L929小鼠成纤维细胞中生长；首先以1000 g离心5 min去除细胞核和部分破碎的细胞，然后以14000 g离心10 min使细菌成球。将颗粒悬浮于磷酸盐缓冲的218 mM蔗糖(含4.9 mM谷氨酸钾)中后，将细菌在14,000 g下通过20% (w/v)碘克沙醇垫(通过OptiPrep与相同缓冲蔗糖的稀释制备)离心制成颗粒10 min。
沙眼衣原体(不同形态)（Chlamydia trachomatis (different morphological forms)）纯化
沙眼衣原体(Chalmydia trachomatis)的持续体、网状体和基本体以54%、44%、40%、34%和24% (v/v)的OptiPrepTM梯度分离，OptiPrep™用广泛使用的218 mM蔗糖磷酸盐缓冲液(含4.9 mM谷氨酸钾)稀释形成。在4℃条件下，以10万g离心1 h，得到24-34%界面上方的持续体、34-40%界面上方的网状体和44%层中的基元体。
蓝藻细胞（Cyanobacteria）纯化
Fujishiro等人用无机盐复合培养基悬浮生物并过滤聚集体；超声处理用于去除致密的胞外多糖基质，超声处理后，将粗制细胞悬液14,000 g离心10 min;将细胞沉淀重悬于复杂培养基中。将悬浮液加载到40-45% (w/v)碘克沙醇梯度上，在112,700 g离心2 h后，蓝细菌在梯度中间条带。因此蓝细菌的条带密度约为1.22 g/ml。
细菌小细胞（Bacterial minicells）纯化
小细胞是细菌细胞异常分裂的产物，含有RNA和蛋白质，但不含染色体DNA。它们“能够在体外和体内将异源抗原递送到刺激免疫应答的I类抗原呈递途径”。一般方法使用2000 g离心10 min去除细菌，10000 g离心30 min从上清液中沉淀小细胞;将颗粒在培养基中重悬，并应用于5-20% (w/v)的碘克沙醇梯度，在20,000 g离心20分钟。从梯度中回收的小细胞含有0.001%的细菌。
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