【Serumwerk】细菌(Bacteria)纯化（一）
细菌纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
细菌(Bacteria)纯化
从土壤、溪流、临床标本和食物中纯化
溶液制备
A. OptiPrep™（使用前轻轻摇瓶）
B. 生理盐水（无菌）或其他合适的缓冲液
试验方法
1. 用2mm筛网筛土壤，并悬浮在盐水中(每100ml 10g土壤)。
2. 在搅拌器(或其他旋转叶片设备)中，在4℃下以全速浸渍3-5分钟，使用1分钟“爆裂”和1分钟“休息”来消散任何热量。
3. 密度屏障法:使用纯OptiPrep™作为屏障，或将10体积的OptiPrep与0.1体积的100倍缓冲液混合。然后将浸渍样品以4:2.5的体积比覆盖在所选密度屏障上。
4. 不连续梯度法:用0.25 M蔗糖、6 mM EDTA、60 mM Tris-HCl、pH 7.4稀释OptiPrep™，制备14%、25%和55% (w/v)碘克沙醇。将每种溶液各分层2 ml放入管中，并将土壤悬浮液(5 ml)分层置于顶部。
5. 密度屏障法:在4℃下10000 - 25000 g离心20-40分钟，然后收获土壤颗粒以上的所有材料。
6. 间断梯度法:2600 g离心1 h;然后抽吸55% (w/v)碘克沙醇层以上的液体。
7. 用3体积无菌生理盐水稀释菌悬液;将细菌在10,000-20,000 g下成球20-60 min并在适宜培养基中重悬。
方法注释
1．分散的精确条件是相当多变的。有些是更温和的，如3×1分钟在低速，在其他的休息时间更长的时间，如5分钟。如果规定了一个速度，它通常是20000 rpm。
2．如果在密度屏障中需要缓冲液和/或盐水，这一稀释步骤只会引起60% (w/v)碘克沙醇密度的小变化。
3．样品和势垒的相对体积也是可变的，但通常样品体积超过了势垒，所给出的比率是常用的。
4．在Pascaud等人最近的一篇论文中，屏障的密度降低到1.20 g/ml，即36% (w/v)碘克沙醇(OptiPrep™用含6 mM EDTA的0.25 M蔗糖缓冲溶液稀释)。
5．Pascaud等使用1.10、1.15和1.30 g/ml的三层梯度；这相当于当OptiPrep™用0.25 M蔗糖缓冲溶液稀释时，14.5,25和55% (w/v)碘克沙醇。经2,600 g离心1 h后，细菌条带位于1.15 g/ml层的顶部
6．离心时间随样品总积+密度屏障而变化;对于较大的容量，可能需要增加时间。
7．细菌通常来自于垫层的表面材料和上半部分。由于屏障的高密度，为了降低所收集液体的密度，需要用缓冲液进行相当大的稀释(可能高达10倍)。
8．用于将细菌制成颗粒的离心条件取决于细菌的沉降特性、收获的缓冲液的数量和稀释后的细菌悬浮液的总体积；它们从16000g 60分钟到100- 200000g 10-20分钟不等。
细菌(Bacteria)纯化
从培养的细胞中纯化
溶液制备
NycodenzⓇ
作为密度屏障溶液，放置50 ml溶液A，其中含有0.26 M NaCl, 6 mM KCl, 0.6 mM CaNa2EDTA, 10 mM Tricine-HCl, pH 7.2，在150毫升烧杯上加热磁搅拌器设置约50℃并添加18 g少量NycodenzⓇ直至溶解。让溶液冷却到室温，然后用水配制多达100毫升。必要时进行过滤消毒。
碘克沙醇
如果选择碘二醇选项，则用2.1 体积的溶液A和2.1 体积的水溶液稀释1.8体积的OptiPrep™。
试验方法
1. 用胰蛋白酶-EDTA在DMEM中正常暴露，使细胞单层分离。
2. 离心收集细胞，在含10% FCS的培养基中洗涤2次。
3. 将细胞悬浮在10倍稀释的磷酸盐缓冲盐水中，在Dounce匀浆器中通过匀浆破坏肿胀的细胞。
4. 在250 g下去除细胞碎片5 min，然后加入等体积的含0.4 M蔗糖的磷酸盐缓冲液来提高匀浆的渗透压。
5. 将悬浮液加载到含有0.13 M NaCl、3 mM KCl、0.3 mM NaCa2-EDTA、5 mM Tris-HCl、pH 7.2的18% (w/v) NycodenzⓇ溶液中，分别在超速离心机或高速离心机的摇桶转子中以35000 g离心40 min(或27000 g离心1 h)。
6. 从界面中获取基本体并在磷酸盐缓冲盐水中洗涤。
方法注释
1. 细菌密度的主要决定因素之一很可能是培养基的渗透压;因此，OptiPrep™稀释剂中的NaCl强度可能需要调节以优化分离。
2. 大多数现代高速转子的管容量；50毫升的容量约27,000 g。
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