【Serumwerk】树突状细胞（Dendritic cells）分离——沉淀法

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Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

树突状细胞分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

肺树突状细胞是在胶原酶消化前，用含肝素的磷酸盐缓冲盐水灌注组织制备的。为了从骨髓细胞培养物中制备DCs，从小鼠股骨和胫骨冲洗出的细胞在含有10 ng/ml IL-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的标准RPMI/10% FCS中培养6天，然后收集松散粘附和非粘附的细胞。

溶液制备

A. OptiPrep™（使用前轻轻摇动瓶子）

B. 稀释剂：0.88%（w/v）氯化钠、1 mM EDTA、0.5%牛血清白蛋白（BSA），10 mM Tricine-NaOH，pH 7.4

C. 密度屏障：2.3体积溶液A+9.7体积溶液B

D. Hank’s平衡盐溶液

试验方法

1．在4℃下进行所有操作，确保所有的溶液和设备都预先冷却。

2．通过540 g离心5 min收集细胞，并在溶液D中洗涤两次。

3．将洗涤细胞颗粒悬浮于该溶液(6 ml)中。

4．将6 ml溶液C或其他选定密度屏障转移到离心管中并覆盖细胞悬液。

5．600-700 g离心5-10 min;如果可以，请使用缓慢加速。

6．允许转子在没有刹车的情况下减速，并从接口获取DCs。

方法注释

1. 在某些情况下，OptiPrep稀释剂是一种添加了FCS和EDTA的培养基。可以使用任何与细胞相容的近似等渗溶液。

2. 这个屏障的密度约为1.067 g/ml，相当于11.6%（w/v）碘二醇；其他人则使用了12%。对于肺树突状细胞，Hansen等采用了4%和16%（w/v）碘二醇的两层梯度。

3. 用于悬浮细胞在密度屏障上分层之前的溶液和用于稀释OptiPrep™的溶液可为任何兼容的等渗培养基。Hansen等人使用含有5% FCS和2 mM EDTA的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)，而Cervantes-Barragan等人用PBS代替HBSS, lucashenak等人用PBS悬浮细胞，用HBSS稀释OptiPrep™(均含有0.2% BSA和2 mM EDTA)。

4. 时间可以增加到20 min。大多数离心机是在4℃下进行的，但可以使用更高的温度。离心条件800g离心20分钟是常见的，但20 min 530g离心20分钟到2800g 15分钟已经有描述。

在两层梯度的情况下，下界面处的DCs带。Eaton等报道，通过流式细胞术判断，从骨髓培养的DCs的纯度约为85%。收获的DCs可以通过使用适当的磁珠进一步纯化。执行这个初始的梯度纯化步骤，可以通过负选择更有效地进行珠粒纯化。

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