【Serumwerk】树突状细胞（Dendritic cells）分离——混合器法
树突状细胞分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™（使用前轻轻摇瓶）
B. 消化溶液：含5%热灭活胎牛血清（FCS）的RPMI，10U/ml胶原酶和5 g/ml DNaseI，pH 7.4。
C. 含5%胎牛血清（FCS）、5 mM EDTA和5 μg/ml DNase I的磷酸盐缓冲盐水（不含Ca2+和Mg2+）。
D. 稀释剂：0.8%（w/v）氯化钠，5 mM EDTA，10 mM Tricine-NaOH，pH 7.4
E.30% 碘二醇工作溶液：等量混合OptiPrep™和溶液D。
试验方法
组织分离
通过分离所选组织的组织制备单细胞悬液的方案可能因实验室而异。
1．将切碎的组织在B溶液中37℃消化10 min。
2．通过一个不锈钢筛子进行消化
梯度分离
在4℃下进行所有的操作，确保所有的解决方案和设备都已预冷。
1．以540 g离心5 min收集细胞，在C溶液中洗涤两次。
2．用19.5体积溶液D稀释10.5体积E溶液，制备10.5%（w/v）碘二醇（ρ = 1.061 g/ml）的等渗溶液。
3．将洗涤后的细胞颗粒以约1.5×108个细胞/ml的速度悬浮在该溶液中。
4．将3-4 ml转移到离心管中，并覆盖2ml FCS。
5．1700 g离心10 min。
6．允许转子在没有制动器的情况下减速，并从FCS/样本交界处获取树突状细胞。
方法注释
1. 所述消化介质的组合物仅以大纲形式给出；其它组份，例如抗生素或谷氨酰胺，可根据操作人员的需要包括在内。
2. 术者应使用任何对选定组织有效的消化方案。然而，重要的是，消化后对细胞的处理应尽可能轻柔，以避免对细胞的潜在损害。将DNase I和/或EDTA包含在细胞培养基中以将任何细胞聚集减少到最低限度。
3. 梯度分离中使用的等渗溶液的组成可调整以适应操作者的要求。EDTA阻止任何聚集。
4. DC密度可取决于梯度前处理以及材料来源。根据经验可能需要调节细胞悬浮培养基的密度。
5. 在DC悬浮液的顶部放置低密度层是很重要的，以避免在空气/水交界处束缚DC。然而，该低密度层也可以是溶液D(±FCS)。
6. 离心条件变化很大；1700 g离心20分钟或低至600 g离心25分钟。
7. 收获的树突状细胞可以使用适当的单抗涂层磁珠进一步纯化。这个初始的梯度纯化步骤允许珠粒更有效地进行纯化。
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