【Serumwerk】猪及灵长类胰岛（Islets of Langerhans）分离
所需溶液制备
A: OptiPrep™（使用前轻轻摇动）
B: OptiPrep™稀释剂：UWS（x2）。
C: 梯度溶液的稀释剂：UWS。
D: 工作溶液（WS，ρ = 1.206 g/ml）：混合等量的溶液A和溶液B，将10ml等分液转移到50 ml锥形离心管中，保持4℃。
E: 低密度屏障溶液（ρ = 1.090 g/ml）：将10 ml WS与26.36 ml UWS混合，保持在4℃。
试验方案
1. 在UWS(或其他选择的培养基)中37℃下用胶原酶消化胰腺组织，然后在UWS中0-4℃下进行所有后续操作(机械分散、过滤等)。
2. 将消化液在4℃ 200 g下离心2 min，并在UWS中轻轻地重新悬浮颗粒，并使用该培养基(例如10-12 ml包装的组织颗粒溶于80 ml)使其体积增大(20 ml的倍数)。
3. 将20 ml消化悬浮液转移到每个已准备好的含有10 ml WS的离心管中，通过反复倒置或在两个离心管之间反复灌注，快速但温和地混合。
4. 将8 ml低密度屏障溶液覆盖于悬浮液上并向管中注入10 ml(1×)UWS。
5. 在4℃下以500 g离心5 min。顶部界面有胰岛带；腺泡组织仍在负荷区。
6. 使用注射器和宽口径金属套管获取胰岛；用等体积(1倍)UWS稀释并在200 g下离心4 min。
方法注释
1．如果使用HBSS或RPMI等培养基进行冷隔离步骤，则组织应在冷UWS中预孵育60分钟，然后添加工作液。然而，梯度可能需要对密度和渗透压进行显著调整。
2．UWS(x2)密度为1.092 g/ml。双强度HBSS或RPMI的密度较低(约1.012 g/ml)，因此需要修改产生适当密度溶液所需的单强度培养基的量。
3．应缓慢而小心地实施乳酸的中和。
4．别嘌呤醇与UWS中保持相同的浓度(1倍)，因为较高的浓度难以溶解。
5．UWS可以从商业上购买，也可以使用溶液B中试剂浓度的一半来制备(别嘌呤醇除外，其浓度应相同)。也可以用等体积的水稀释溶液B(检查pH值仍为7.4)，但请注意别嘌呤醇浓度将是UWS中正常浓度的一半(1倍)。
6．根据所使用的分离方法或如果胰岛是从其他物种纯化，可能需要调节这一层的密度。
7．在RPMI中产生屏障解决方案可能是一个优势;这可以作为从UWS中清洗胰岛的初步手段，因为它们漂浮到上层界面。用RPMI或含10%血清的RPMI稀释OptiPrep™制备的屏障液均获得良好的结果：3.2 ml OptiPrep™和8.8 ml RPMI的溶液（ρ = 1.090 g/ml）；若使用含10%血清的RPMI，密度约为1.092 g/ml。
8．最近有人提出，通过将RCF降低到100 g，可以提高回收率、纯度、对碎片化的抵抗和胰岛素对葡萄糖的反应。因此可能需要更长的离心时间。
9．胰岛层中不可接受的腺泡组织污染水平通常意味着屏障层的密度过高，应予以降低。
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