【Serumwerk】祖细胞富集部分（Progenitor cell-enriched fraction）分离
沉淀法
溶液制备
A. OptiPrep™（使用前轻轻摇瓶）
B. Viscose's modified Dulbecco’s medium Hank’s (IMDM)
C. 胎牛血清（FCS）
D. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）
E. Tricine缓冲盐水
试验方法
在室温下进行所有操作
1．在含有2% FCS的B溶液中收集骨髓材料。
2．通过25号针头三次分离骨髓细胞。
3．通过200 μm尼龙网过滤悬架。
4．为了制备约395 mOsm的密度屏障溶液，直接用溶液D或E（含或不含5% FCS）稀释OptiPrep™，得到所选密度的溶液。
5．用水稀释溶液E，制备1.077 g/ml，渗透压约为265mOsm（约为1.077A），渗透压为1.077 g/ml；该溶液的渗透压约为242 mOsm。用OptiPrep™稀释成242 mOsm溶液，体积比分别为2.7：9.3。
6．使用5 ml骨髓细胞悬液(107个细胞/ml）覆盖3 ml选择的密度屏障。
7．450 g离心20 min，允许转子在没有制动器的情况下减速。
从界面上收集细胞；用等体积的D或E溶液（+ 5% FCS）稀释；洗涤两次，然后在同一培养基中重悬。
方法注释
1. 为了稀释OptiPrep™使用任何合适的介质，给出了两个例子作为溶液D或E;也可使用培养基。只要溶液是等渗的，那么稀释也是等渗的。
2. 一些论文报告使用4℃的离心温度。
3. 步骤5阐述替代低渗透压OptiPrep™密度溶液的制备。
4. 用任何等渗培养基(包括培养基)稀释OptiPrep™将得到与表1中所示相同的密度。该等稀释剂均具有约1.006 g/ml之密度。然而，FCS的加入将略微上调密度。FCS的密度约为1.032 g/ml，因此，例如任何含有10% FCS的平衡盐溶液的密度将为1.009 g/ml。表1中给出的OptiPrep™/盐水混合物的密度将增加0.002-0.003 g/ml。如果使用5%的FCS，密度差成比例地更小。
5. 由于巨核细胞祖细胞的密度低于大多数其他类型的细胞，因此可能值得考虑使用浮选策略，其中将骨髓细胞悬液调整为屏障密度(例如1.085 g/ml)，并从溶液顶部收获祖细胞。这种方法已用于胎肝细胞。
6. 已发表的重力、时间和温度值变化较大。较低或较高的值对分离的影响只能通过实验来确定。
7. 使用制动器可能会在液体中产生涡旋，导致界面带的定义丢失，甚至造成更密集的细胞的污染。
混合器法
将粗制细胞悬液为PBS + 5% FCS (30 ml)与10.1 ml OptiPrep™和4 ml水混合，将细胞悬浮培养基调节至约1.077 g/ml；
在细胞顶部放置少量的缓冲盐水，以防止离心过程中低密度细胞在气液界面条带。该方法避免了在标准屏障沉降方法中样品和密度屏障之间的界面上细胞的积聚和可能的聚集。它允许较密集的细胞沉淀，而低密度的细胞漂浮。在样品制备中使用的4 ml水，如果需要，当然可以用生理盐水代替，而不会影响分离。
不连续梯度法
使用0.7%（w/v）氯化钠，10毫米，pH 7.0稀释OptiPrep™工作溶液1.050,1.080,1.090 g/ml(约碘二醇浓度分别为8.4、14和16% w/v)。梯度在400 g下离心15 min，分离出低密度部分。
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