【Cellntec】人黑色素细胞的分离（Human Melanocyte Isolation）

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人黑色素细胞 Human Melanocyte Isolation 皮肤细胞系统 Dermal Cell System 人原代细胞分离 Cellntec Human Primary cells Isolation CnT-40 Melanocyte Proliferation Medium CnT-40

小白求助前辈指路

人黑色素细胞分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

人黑色素细胞的分离

（Human Melanocyte Isolation）

本操作描述了使用CnT-40培养基从包皮或成年皮肤中分离原代黑色素细胞的方法。一般来说，年轻的供体组织提供的细胞具有更强的增殖能。

操作步骤

1.手术切除后，将皮肤直接放入CnT-40培养基中（50 mL管中加入20 mL培养基），4°C下存储，直到开始分离（最好在手术后的24 h内开始）。

2.将皮肤放入培养皿中。使用手术刀切成相等大小的块。将皮肤块放入15 mL的离心管中（含有10 mL的1×dispase溶液，以及2×G/A），4°C下水平放置，过夜孵育皮肤块（约16 h）。

3.第二天将所有的皮肤块连同dispase溶液转移到一个培养皿中。将每个皮肤块转移到含有CnT-40培养基的新培养皿中，以洗去多余的dispase。用两对弯镊轻轻分离真皮（粉红色、不透明、黏稠）和表皮（白色、半透明），一只镊子固定组织，另一只镊子将表皮剥离。（如果不容易分离，将组织放回含有dispase溶液的培养皿中，在室温下再处理30~60 min）。

4.根据组织大小，选择将10 mL CnT-40培养基和1×G/A加入到15 mL离心管中或将20 mL CnT-40培养基和1×G/A加入到50 mL离心管中。使用一对无菌镊子将分离的表皮片段转移到已经准备好的离心管中。可以使用手术刀将较大的片段切碎，以便在下一步中更好地分离基底细胞。

5.使用10毫升无菌移液管，将含有表皮片段的培养基上下移液40到50次，以释放细胞。通过70~100 µm的细胞过滤器将悬浮液中的单个细胞分离。用10 ml含有1×G/A的CnT-40培养基冲洗细胞过滤器上残余的单个细胞。200 g室温离心5 min收集细胞。

6.弃除上清液，用1~2 ml的CnT-40培养基重悬细胞沉淀。统计细胞数量。将活细胞以4 ×10⁴ cells/cm²的密度接种在含有1×G/A的CnT-40培养基的培养容器中，置于细胞培养箱中培养。

表 1 Human Melanocyte 分离材料