【Cellntec】人表皮角质细胞的分离（Human Epidermal Keratinocyte-HEK Isolation）
人表皮角质细胞分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
人表皮角质细胞的分离
（HEK Isolation）
本操作步骤描述使用CnT-Prime（CnT-PR）培养基分离来自包皮组织的原代角质形成细胞。通常情况下，年轻的供体组织提供了最高的细胞产量，因此在可能的情况下推荐使用幼年的包皮组织。
操作步骤
1.将培养基、PBS、Accutase以及所用到的酶等提前置于室温平衡。
2.将包皮在割包皮手术后直接放入CnT-XP3培养基中（50 mL管中加入15 mL培养基）。推荐将组织保存在4°C，直到傍晚开始分离。
3.将包皮放入培养皿中，使用手术刀将其切成4个大小相等的片段。放入15 mL离心管中，加入10 mL 1× dispase溶液（使用CnT-DNP-10制备），以及2倍的G/A。在4°C下孵育过夜（约15小时）。
4.第二天将包皮连同dispase溶液转移到培养皿中。将每个组织片转移到含有PBS的培养皿中，清洗去多余的dispase后，去除并加入CnT-PR培养基将皮肤浸泡。用两对弯曲的镊子轻轻将真皮（粉红色、不透明、黏稠）与表皮（白色、半透明）分离。一只镊子固定组织，另一只镊子将表皮剥离。（如果不易分离，将组织放回含有dispase溶液的培养皿中，在室温下再孵育30到60 min）。
5.使用一只镊子将表皮从CnT-PR培养基中取，慢慢将其转移到胰蛋白酶表面，使基底层朝下。组织应该再次展开并平铺在液滴表面上，如果没有，可以用第二对弯曲的镊子轻轻摇动组织下方来去除任何褶皱。
6.在室温下孵育20-30 min（用盖子盖住培养皿以防止蒸发）。
7.将培养皿倾斜约30°角，并向表皮中加入2 mL CnT-PR培养基（稀释残留的胰蛋白酶）。保持培养皿倾斜（通过将一侧抬起到盖子上）使细胞的收集更加高效。轻轻在培养皿底部的一个小区域上轻柔晃动，将单个细胞与细胞层分离。下方的培养基会变得越来越浑浊。
8.使用1到2 mL新鲜培养基将单个细胞冲洗到倾斜培养皿的底部。将单个细胞溶液转移至15 mL离心管中。再次添加2 mL CnT-PR培养基后轻柔晃动，并将细胞悬浮液收集到同一个15 mL离心管中。室温180 × g的速度离心5 min。
9.吸去上清液，将细胞沉淀重悬于2 mL CnT-PR培养基中，细胞计数。最初以2 × 104个细胞/cm2的密度在培养容器中接种活细胞（在后续传代中，密度可以降低至4,000个细胞/cm2）。
10.在最初的3天内，使用添加IsoBoost的CnT-PR培养基培养细胞，随后切换到标准的CnT-PR培养基。在37°C和5% CO2下培养细胞。在24小时后更换培养基以去除未附着的细胞，然后在3天后再次更换（初始时细胞密度较低时避免过于频繁的更换培养基，因为这也会去除细胞分泌的有益因子）。
表 1 HEK分离材料
注：CnT-IsoBoost是一种无菌的 1000 × 即用型浓缩液，在分离后立即添加到培养基中，用于培养的前3天，可显着提高原代人类细胞的活力和附着力。
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