【Cellntec】脂肪间充质干细胞的分离（Adipose-Derived MSC Isolation）
脂肪间充质干细胞分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
脂肪间充质干细胞的分离
（Adipose-Derived MSC Isolation）
本操作描述使用CnT-Prime MSC培养基，从成人皮下脂肪组织中分离间充质干细胞（adMSC）的方法。
操作步骤
该方案中描述的试剂用于3 g脂肪组织的分离，对于更大量的分离，按比例增加试剂用量。推荐#CnT-PR-MSC或#CnT-PR-MSC-XF（在方案中称为CnT-Prime MSC培养基）以获得最大的分离效率。在第一次扩增传代结束时，细胞产量通常在300-400万个细胞的范围内。
1.将培养基、PBS、Accutase以及所用到的酶等提前置于室温平衡。
2.为了获得最大的细胞产量，将组织活检样本存储在4°C的#CnT-XP3活检维持培养基中，直到开始分离为止。
3.将脂肪组织放入培养皿中，洗去任何血液，并使用手术刀切下3克的样本，并彻底切碎组织块，直到形成完全均质的浆状物（5-10 min）。将均质的细胞浆转移到10 mL经过滤消毒的胶原酶Ι溶液（浓度为2 mg/mL），其含有1倍抗生素（#CnT-GAB10），以获得最大的热稳定性和pH稳定性。
4.37°C孵育1.5 h，每30 min轻轻涡旋一次。
5.加入10 mL CnT-Prime MSC培养基稀释酶溶液，并等待脂肪层分离。用移液管移除下层的清澈溶液，并依次通过100 µm和70 µm的滤网过滤。以200 g的速度离心过滤后的溶液5 min，用移液管吸弃表面的脂质层和上清液。
6.加入1 mL CnT-Prime MSC培养基重悬沉淀物（基质血管组分），随后加入3 mL溶血红细胞裂解缓冲液，并在室温下孵育5-10 min（取决于红细胞的数量）。
7.加入10 mL CnT-Prime MSC培养基至溶血红细胞裂解缓冲液中，以200g的速度离心5 min。去除上清液，加入1 mL培养基重悬细胞沉淀物，并对细胞计数。20,000 cells/cm2的密度在含有1倍抗生素的CnT-Prime MSC培养基中接种细胞，并在细胞培养箱中过夜培养。
8.第二天更换培养基，然后每隔一天进行一次培养基的更换，直到细胞达到充分生长（通常为6-7天）。
9.在细胞达到充分生长之前进行细胞传代（推荐使用Accutase），重新以2,000 cells/cm2密度接种。在传代后的进一步培养中，建议不使用抗生素。
表 1 Adipose-Derived MSC 分离材料
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