【Cellntec】人皮肤成纤维细胞的分离（Human Dermal Fibroblasts- HDF Isolation）
人皮肤成纤维细胞分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
人皮肤成纤维细胞的分离
（HDF Isolation）
本操作步骤描述使用CnT-PR-F培养基分离来自包皮的原代皮肤成纤维细胞的过程。CnT-PR-F是一种含1%血清培养基，具有改善的分离效率和生长速率的优点。通常，年轻的供体组织能提供具有更大增殖能力的细胞。有关推荐的解冻、传代和冻存方案，请参阅www.cellntec.com资源部分的一般培养方案。
操作步骤
1. 将培养基、PBS、Accutase以及所用到的酶等提前置于室温平衡。
2. 将割下的包皮直接放入CnT-PR-F培养基中（50 mL管中加入15 mL培养基）。将组织保存在4°C，直到傍晚开始分离。
3. 将包皮组织放入培养皿中。使用手术刀将其切成4个大小相等的片段。放入15 mL离心管中，加入10 mL 1× dispase溶液（使用CnT-PR-F将CnT-DNP-10稀释成1×），以及2倍的抗生素/抗真菌剂（CnT-GAB10）。在4°C下过夜孵育（约16小时）。第二天将组织片连同dispase转移至培养皿中。
4. 每个组织片转移到含有PBS的新培养皿中，洗去多余的dispase后加入新PBS。
5. 用两对弯曲的镊子轻轻将真皮（粉红色、不透明、黏稠）与表皮（白色、半透明）分离。一只镊子固定组织，另一只镊子将表皮剥离。（如果不易分离，将组织放回含有dispase溶液的培养皿中，在室温下再孵育30到60 min）。
6. 使用新的手术刀片将真皮切成非常小的碎片，将碎片转移到50 mL离心管中，加入5 mL胶原酶A（用CnT-PR-F将其配制成浓度为1 mg/mL），以及0.5倍G/A。在37°C下孵育4-8 h，期间轻柔晃动（幼年的皮肤消化速度比成年人快）。
7. 加入15 mL CnT-PR-F培养基稀释胶原酶，通过上下移液混合，然后通过70 μm细胞过滤器获得单细胞悬浮液。
8. 在室温下以5 min，200×g的速度离心单细胞悬浮液。弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL CnT-PR-F中。进行细胞计数，并在CnT-PR-F中以约4,000个细胞/cm2的密度进行接种，置于细胞培养箱中进行培养。
9. 24-48 h后进行第一次培养基更换。每2-3天更换一次培养基。
10. 可使用Accutase或适当的胰蛋白酶进行细胞传代。为了获得最大扩增速率，传代后推荐的接种密度为1,000个细胞/cm2。
表 1 HDF分离材料
注：Accutase（Cat＃CnT-Accutase-100）是从甲壳动物中分离得到的一种蛋白酶和胶原酶混合物。它不含哺乳动物成分。由于其温和的作用可以保持大部分表面蛋白的完整性，并且不需要单独的试剂来停止反应（只需在分离后立即用培养基稀释即可），因此Accutase是推荐的分离酶。Accutase对热敏感，必须在4°C下储存。在使用前，只需将所需量预先加热至20°C。暴露于较高温度或反复加热/冷却循环可能会导致活性降低。
Trypsin/EDTA是一种含有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶的蛋白酶溶液。胰蛋白酶是非定义的，来源于猪。它可能会因批次而异，并且必须在细胞分离后立即用单独的试剂进行灭活（最好使用不含动物成分的抑制剂，或者使用FCS）。胰蛋白酶比Accutase更具侵袭性，导致成功分离和不可逆细胞损伤之间的时间窗口非常短。如果使用胰蛋白酶，必须特别小心地减少暴露时间，并确保快速灭活。
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