【Lonza】人牙周韧带成纤维细胞（HPLF）产品使用攻略

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小白求助前辈指路

人牙周韧带成纤维细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

人牙周韧带成纤维细胞

（HPLF）

牙周膜是位于牙齿的牙骨质和下颌骨的牙槽骨之间的结缔组织。在牙周组织的维持和再生中发挥着不可或缺的作用。负责维持这种组织的细胞被认为是成纤维细胞，它可以是多能的或由功能不同的异质性细胞群组成。尽管与牙龈成纤维细胞形态相似，牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament fibroblasts，PLF）在维持组织完整性方面表现出不同的功能活性。PLF可产生成骨细胞相关的细胞外基质蛋白，与牙龈成纤维细胞相比表现出更高的碱性磷酸酶活性。PLF积极参与牙周病中的免疫和炎症事件。

HPLF分离自人牙周组织，呈纺锤型，其fibronectin特异性抗体免疫荧光染色呈阳性。

培养方式

培养基：用提供的完全培养基（包含Basal Medium和其他补充剂）培养。

操作步骤

1) 完全培养基的配制：将室温融化的补充剂用移液器上下轻柔混匀，并全部加入到Basal Medium中并混合均匀，4℃避光保存。

2) T-25中加入5 mL完全培养基。在细胞播种前，在细胞培养箱中预平衡至少30 min。将解冻后的细胞转移到预热的完全培养基中（按3500 cells/cm²的密度），并置于细胞培养箱中培养。

换液：在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，之后每隔三天更换一次培养基。

传代：当细胞密度60%~80%时进行传代。

1) 将T/E、HEPES、TNS和培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。

2) 弃除旧培养基，并用5 ml HEPES清洗细胞后吸除，加入2 mL Trypsin/EDTA溶液。室温下分离细胞（2-6 min），用显微镜检查细胞。当超过90%的细胞开始脱落时，轻轻敲击容器的侧面以松动剩余的细胞，加入4 mL TNS并轻轻摇动，小心地吸取细胞悬浮液并快速转移到15 mL离心管中。用2 ml HEPES收集残余的细胞并转移至离心管中。以220×g的速度离心细胞5 min。弃掉上清液，加入2-3 mL完全培养基，并通过小心地上下吸移来重悬细胞并对活细胞计数。按3500 cells/cm²接种密度将细胞分装到预先预热至37°C的含完全培养基的培养瓶（1 ml/5 cm²的量添加培养基），或根据实验设计安排种植密度，并放入培养箱中培养，每两到三天更换培养基。（传代至单层细胞需6-9天）

生长条件

在CO₂浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。

表 1 HPLF培养材料

参考文献

[1] Han X, Amar S. (2002) “Identification of genes differentially expressed in cultured human periodontal ligament fibroblasts vs. human gingival fibroblasts by DNA microarray analysis.” J Dent Res. 81(6):399-405.

[2] Murakami Y, Kojima T, Nagasawa T, Kobayashi H, Ishikawa I. (2003) “Novel isolation of alkaline phosphatasepositive subpopulation from periodontal ligament fibroblasts.” J Periodontol. 74(6):780-6.

[3] Takashiba S, Naruishi K, Murayama Y. (2003) “Perspective of cytokine regulation for periodontal treatment: fibroblast biology.” J Periodontol. 74(1):103-10.

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