【ATCC】人体膀胱平滑肌细胞（HBdSMC）培养技术

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人原代细胞 Human Primary cells 尿道细胞系统 Urinary tract cell system ATCC 人体膀胱平滑肌细胞 Bladder Smooth Muscle Cells Vascular Cell Basal Medium PCS-100-030

小白求助前辈指路

人体膀胱平滑肌细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

人体膀胱平滑肌细胞

（HBdSMC）

膀胱是由平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMC）组成的中空器官。膀胱平滑肌的松弛和收缩分别允许膀胱储存和排空尿液。膀胱SMC的表型调节和诱导型一氧化氮合酶的表达与各种病理状态相关，包括膀胱功能障碍。研究表明，缺氧抑制人膀胱SMC增殖，膀胱SMC分化依赖于尿路上皮细胞释放的因子。膀胱SMC细胞外基质的分泌表型可通过所经历的机械变形的频率来改变。SMC增殖是多种疾病发生和发展的主要促进因素。因此，了解SMC在疾病发生和维持过程中的变化对治疗方法的开发至关重要。HBdSMC的α-smooth muscle actin（α-SMA）特异性免疫荧光染色呈阳性。

细胞复苏

1)根据细胞总数，确定接种所需的培养表面积，以达到2,500~5,000 cells/cm²初始接种密度。

2)准备所需培养容器。每25 cells/cm²的表面积加入5 mL完全生长培养基。将培养容器放入37°C、5% CO₂、湿度控制的细胞培养箱中预平衡30分钟。期间，取出冻存细胞，并在37°C的水浴中轻轻摇动使细胞迅速解冻（大约1~2分钟）。一旦内容物解冻，立即将冻存管从水浴中取出，并通过浸入或喷洒70%乙醇进行消毒。从此时起，所有操作都应在严格的无菌条件下进行。

3)将适量的完全生长培养基加入至无菌离心管管中。使用巴氏管，将细胞从冷冻瓶转移离心管中。轻轻吸取细胞以均匀悬浮液，不要离心。细胞计数后根据推荐的细胞接种密度，将细胞加入预平衡的培养容器中轻轻摇动以使细胞分布均匀。

4)将接种的培养容器放入细胞培养箱中培养。在进一步处理细胞之前，孵育至少24小时。

细胞传代

1)当细胞密度达到约80%时，进行传代。

2)在解离之前，将原代细胞的Typsin-EDTA（ATCC PCS-999-003）和胰蛋白酶中和溶液（ATCC PCS-999-004）室温平衡。将完全的生长培养基加热至37°C，以便与细胞一起使用。

3)小心吸去废液（不要干扰细胞单层）。用3~5 mL D-PBS（ATCC 30-2200）洗涤细胞层，以去除残留的血清。

4)向每个细胞培养容器内加入Trypsin-EDTA溶液（每25cm²加1~2mL）轻轻晃动，确保Trypsin-EDTA溶液完全覆盖细胞。

5)显微镜下观察细胞。当细胞相互分离并变圆（通常在3~5分钟内），并轻轻从多个方向敲击培养容器，促使细胞从表面脱离。当大部分细胞脱离时，迅速加入相同体积的胰蛋白酶中和溶液（ATCC PCS-999-004）。轻轻吸取或旋转培养物，确保所有Trypsin-EDTA溶液已被中和。

6)将解离的细胞转移到无菌离心管中，同时向容器中加入3~5 mL D-PBS（ATCC 30-2200），以收集残留细胞。将细胞/D-PBS悬浮液转移到含有胰蛋白酶-EDTA解离细胞的离心管中。

7)150 g的速度离心细胞3~5分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于2~8毫升新鲜的、预热的完全生长培养基中。计数细胞，并以2,500~5,000 cells/cm²的密度接种新的培养容器中，并放入细胞培养箱中。至少孵育24~48小时，然后再进一步处理细胞。

细胞换液

1)将适当的完全生长培养基提前至于37°C进行预热（避免多次预热）。

2)接种后24小时，将细胞从培养箱箱中取出，显微镜下观察以确定细胞的汇合度。

3)小心地去除废液，不要干扰细胞单层。按每25 cm2的表面积加入5 mL新鲜预热的完全生长培养基，并将烧瓶放回培养箱中。

4）经过24~48小时，再次观察，以确定细胞的汇合度。如果还没有准备好传代，重复上述步骤。当培养达到约75~80%的汇合度（汇合度过高HBdSMC会发生接触性抑制，影响传代后细胞的生长活力），并且细胞正在活跃增殖（许多有丝分裂图像可见）时，准备进行传代。注意：当细胞按2,500 cells/ cm2密度接种时，细胞通常在培养4~6天后准备好传代。

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