【ScienCell】人结膜上皮细胞（HConEpiC）产品使用攻略
人结膜上皮细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
人结膜上皮细胞
(HConEpiC）
结膜是一层透明的薄膜，覆盖在眼睑的内表面并覆盖巩膜，由两层分层、非角化的结膜上皮细胞（ConEpiC）组成。通过特定的角蛋白表达谱，可以区分ConEpiC与角膜上皮。ConEpiC被富含黏液的糖基胶覆盖，促进泪液附着，防止病原体渗透，并提供润滑作用。黏液/糖基胶的减少或丧失会导致鳞状上皮化生，可能导致干眼症和眼表疾病。ConEpiC还通过刺激磷脂酰肌醇周转和分泌细胞因子来对组织胺作出反应，因此应用于治疗过敏性结膜炎的局部眼药物的开发。HConEpiC在无血清培养基中呈鹅卵石状，其可通过cytokeratin-18和cytokeratin-19特异性抗体免疫荧光染色鉴定。
培养方式
培养瓶：PLL（多聚-L-赖氨酸）包被的培养瓶。
培养基：HConEpiC用提供的CEpiCM完全培养基（包含基础培养基、1% CEpiCGS和1%P/S）中培养
操作步骤：
1) 包被PLL（2 μg/cm2）培养瓶（T-75培养瓶）的准备：将10 mL无菌水加入到T-75培养瓶中，加入15 μL PLL原液，轻轻吹匀后将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少1小时）。
2) 无菌水清洗包被PLL的T-75 2次，加入20 mL CEpiCM完全培养基（基础培养基、CEpiCGS和P/S按比例配制），将解冻后的HConEpiC加入至包被的T-75中，十字交叉法轻柔摇晃培养瓶使细胞分布均匀，将培养瓶放入细胞培养箱中。（注：不建议在解冻后稀释和离心细胞，因为这些操作对细胞的伤害比培养中残留的二甲基亚砜（DMSO）的影响更大。同时，细胞在PLL包被培养瓶中有助于促进细胞附着。）
换液：为了获得最佳结果，在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，之后每隔三天更换一次培养基，直到培养达到约70%的密度，一旦培养达到约70%的密度，每隔一天更换一次培养基，直到培养达到约90%的密度。
传代：当细胞密度达到95%时进行传代。
1) 将T/E、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。
2) 弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除加入10 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱（注：原代细胞传代时请勿使用未稀释的胰蛋白酶），一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入5 mL FBS（#0500）终止消化，将细胞悬液转移至50 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据5000 cells/cm2的密度传代至预先用PLL包被的培养瓶中。
生长条件：在CO2浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。
表1 HConEpiC培养材料
参考文献
[1] Paladino G, Marino C, La Terra Mule S, Civiale C, Rusciano D, Enea V. (2004) “Cytokeratin expression in primary epithelial cell culture from bovine conjunctiva.” Tissue Cell. 36: 323-32.
[2] Koufakis DI, Karabatsas CH, Sakkas LI, Alvanou A, Manthos AK, Chatzoulis DZ. (2006) “Conjunctival surface changes in patients with Sjogren's syndrome: a transmission electron microscopy study.” Invest Ophthalmol Vis Sci. 47:541-4.
[3] Yanni JM, Weimer LK, Sharif NA, Xu SX, Gamache DA, Spellman JM. (1999) “Inhibition of histamine-induced human conjunctival epithelial cell responses by ocular allergy drugs.” Arch Ophthalmol. 117: 643-7.
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