【ATCC】人皮下前体脂肪培养技术

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人皮下前体脂肪 Human Subcutaneous Pre-adipocytes 人原代细胞 Human Primary cells 脂肪细胞系统 Adipose Cell System ATCC Fibroblast Basal Medium PCS-201-030

小白求助前辈指路

人皮下前体脂肪培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

细胞复苏

1)根据细胞总数，确定接种所需的培养表面积，以达到5,000 cells/cm²初始接种密度。

2)准备所需培养容器。每25 cells/cm²的表面积加入5 mL完全生长培养基。将培养容器放入37°C、5% CO₂、湿度控制的细胞培养箱中预平衡30分钟。期间，取出冻存细胞，并在37°C的水浴中轻轻摇动使细胞迅速解冻（大约1~2分钟）。一旦内容物解冻，立即将冻存管从水浴中取出，并通过浸入或喷洒70%乙醇进行消毒。从此时起，所有操作都应在严格的无菌条件下进行。

3)将适量的完全生长培养基加入至无菌离心管管中。使用巴氏管，将细胞从冷冻瓶转移离心管中。轻轻吸取细胞以均匀悬浮液，不要离心。细胞计数后根据推荐的细胞接种密度，将细胞加入预平衡的培养容器中轻轻摇动以使细胞分布均匀。

4)将接种的培养容器放入细胞培养箱中培养。在进一步处理细胞之前，孵育至少24小时。

细胞传代

1)当细胞密度达到70%~80%时，进行传代。

2)在解离之前，将原代细胞的Typsin-EDTA（ATCC PCS-999-003）和胰蛋白酶中和溶液（ATCC PCS-999-004）室温平衡。将完全的生长培养基加热至37°C，以便与细胞一起使用。

3)小心吸去废液（不要干扰细胞单层）。用3~5 mL D-PBS（ATCC 30-2200）洗涤细胞层，以去除残留的血清。

4)向每个细胞培养容器内加入Trypsin-EDTA溶液（每25cm²加1~2mL）轻轻晃动，确保Trypsin-EDTA溶液完全覆盖细胞。

5)显微镜下观察细胞。当细胞相互分离并变圆（通常在3~5分钟内），并轻轻从多个方向敲击培养容器，促使细胞从表面脱离。当大部分细胞脱离时，迅速加入相同体积的胰蛋白酶中和溶液（ATCC PCS-999-004）。轻轻吸取或旋转培养物，确保所有Trypsin-EDTA溶液已被中和。

6)将解离的细胞转移到无菌离心管中，同时向容器中加入3~5 mL D-PBS（ATCC 30-2200），以收集残留细胞。将细胞/D-PBS悬浮液转移到含有胰蛋白酶-EDTA解离细胞的离心管中。

7)250 g的速度离心细胞3~5分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于2~8毫升新鲜的、预热的完全生长培养基中。计数细胞，并以5,000 cells/cm²的密度接种新的培养容器中，并放入细胞培养箱中。每隔2~3天换液一次，然后再进一步处理细胞。

细胞换液

1)将适当的完全生长培养基提前至于37°C进行预热（避免多次预热）。