【ATCC】人表皮角质形成细胞（HEK）培养技术

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人原代细胞 Human Primary cells 皮肤细胞系统 Dermal Cell System ATCC 人表皮角质形成细胞 Epidermal Keratinocytes Dermal Cell Basal Medium PCS-200-030

小白求助前辈指路

人表皮角质形成细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

人表皮角质形成细胞

（HEK）

皮肤的表皮层在抵御外界环境的侵害方面提供了重要的保护屏障功能。表皮中的主要细胞类型是角质细胞，它们位于分层鳞状上皮组织中。角质细胞是以角蛋白命名的，角蛋白是该细胞中最丰富的蛋白质。角质细胞的祖细胞位于表皮的基底层，进行分裂，然后会分化并向表皮表面迁移，最终永久退出细胞周期。角质细胞的增殖、分化和程序性细胞死亡是复杂而精心协调的过程。除了其保护功能外，角质细胞还表达粘附分子和细胞因子，在皮肤先天免疫、组织稳态、伤口愈合、肿瘤发展发挥重要作用。HEK分离自成人皮肤，其cytokeratin-18和cytokeratin-19的特异性抗体免疫荧光染色呈阳性。

细胞复苏

1)根据细胞总数，确定接种所需的培养表面积，以达到2,500~5,000 cells/cm²初始接种密度。

2)准备所需培养容器。每25 cells/cm²的表面积加入5 mL完全生长培养基。将培养容器放入37°C、5% CO₂、湿度控制的细胞培养箱中预平衡30分钟。期间，取出冻存细胞，并在37°C的水浴中轻轻摇动使细胞迅速解冻（大约1~2分钟）。一旦内容物解冻，立即将冻存管从水浴中取出，并通过浸入或喷洒70%乙醇进行消毒。从此时起，所有操作都应在严格的无菌条件下进行。

3)将适量的完全生长培养基加入至无菌离心管管中。使用巴氏管，将细胞从冷冻瓶转移离心管中。轻轻吸取细胞以均匀悬浮液，不要离心。细胞计数后根据推荐的细胞接种密度，将细胞加入预平衡的培养容器中轻轻摇动以使细胞分布均匀。

4)将接种的培养容器放入细胞培养箱中培养。在进一步处理细胞之前，孵育至少24小时。

细胞传代

1)当细胞密度达到约70%~80%时，进行传代。

2)在解离之前，将原代细胞的Typsin-EDTA（ATCC PCS-999-003）和胰蛋白酶中和溶液（ATCC PCS-999-004）室温平衡。将完全的生长培养基加热至37°C，以便与细胞一起使用。

3)小心吸去废液（不要干扰细胞单层）。用3~5 mL D-PBS（ATCC 30-2200）洗涤细胞层，以去除残留的血清。

4)向每个细胞培养容器内加入Trypsin-EDTA溶液（每25cm²加1~2mL）轻轻晃动，确保Trypsin-EDTA溶液完全覆盖细胞。

5)显微镜下观察细胞。当细胞相互分离并变圆（通常在3~5分钟内），并轻轻从多个方向敲击培养容器，促使细胞从表面脱离。当大部分细胞脱离时，迅速加入相同体积的胰蛋白酶中和溶液（ATCC PCS-999-004）。轻轻吸取或旋转培养物，确保所有Trypsin-EDTA溶液已被中和。

6)将解离的细胞转移到无菌离心管中，同时向容器中加入3~5 mL D-PBS（ATCC 30-2200），以收集残留细胞。将细胞/D-PBS悬浮液转移到含有胰蛋白酶-EDTA解离细胞的离心管中。

7)150 g的速度离心细胞3~5分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于2~8毫升新鲜的、预热的完全生长培养基中。计数细胞，并以2,500~5,000 cells/cm²的密度接种新的培养容器中，并放入细胞培养箱中。至少孵育24~48小时，然后再进一步处理细胞。

细胞换液

1)将适当的完全生长培养基提前至于37°C进行预热（避免多次预热）。