【ScienCell】人颅骨成骨细胞（HCO）产品使用攻略
人颅骨成骨细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
人颅骨成骨细胞
（HCO）
骨骼是一种动态组织，通过破骨细胞和成骨细胞的协调作用不断重塑。成骨细胞是骨形成细胞，最初来源于多能间充质干细胞，合成和分泌有机的胞外基质-骨基质，主要由I型胶原组成。骨基质由成骨细胞钙化，这个过程中，细胞被包裹在钙化物质内的小腔中，成为骨细胞。成骨细胞表达蛋白酶激活受体-1和血管内皮细胞生长因子。研究表明，白血病抑制因子可以与成骨细胞细胞表面结合，并在体外和体内诱导骨形成。在颅骨缝合线之间，成骨细胞的招募、增殖、分化和凋亡的平衡对颅骨形成至关重要。HCO分离自人头骨，成骨细胞碱性磷酸酶染色呈阳性。
HCO培养方式
培养瓶：PLL（多聚-L-赖氨酸）包被的培养瓶。
培养基：HCO用提供的ObM完全培养基（含基础培养基、5% FBS、1% ObGS和1% P/S）培养。
操作步骤：
1)包被PLL（2 μg/cm2）培养瓶（T-75培养瓶）的准备：将10 mL无菌水加入到T-75培养瓶中，加入15 μL PLL原液，轻轻吹匀后将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少1小时）。
2)无菌水清洗包被PLL的T-75 2次，加入20 mL完全培养基，将解冻后的HCO加入至包被的T-75中，十字交叉法轻柔摇晃培养瓶使细胞分布均匀，将培养瓶放入细胞培养箱中。（注：不建议在解冻后稀释和离心细胞，因为这些操作对细胞的伤害比培养中残留的二甲基亚砜（DMSO）的影响更大。同时，将细胞置于PLL涂层培养有助于促进细胞附着。）
换液：为了获得最佳结果，在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，之后每隔三天更换一次培养基，直到培养达到约70%的密度，一旦培养达到约70%的密度，每隔一天更换一次培养基，直到培养达到约90%的密度。
传代：当细胞密度达到90%-95%时进行传代。
1)将T/E、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。
2)弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除，加入5 mL DPBS和5 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱，一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入2 mL FBS（#0500）终止消化，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据5000 cells/cm2的密度传代至预先用PLL包被的培养瓶。
生长条件：在CO2浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。
表 1 HCO培养材料
参考文献
[1] Steinbrech DS, Mehrara BJ, Saadeh PB, Greenwald JA, Spector JA, Gittes GK, Longaker MT. (2000) “VEGF expression in an osteoblast-like cell line is regulated by a hypoxia response mechanism.” Am. J. Physiol. Cell Physiol.278: C853-C860.
[2] Dazai S, Akita S, Hirano A, Rashid MA, Naito S, Akino K, Fujii T. (2000) “Leukemia inhibitory factor enhances bone formation in calvarial bone defect.” J. Craniofac. Surg. 11(6):513-20.
[3] Marie PJ, Debiais F, Hay E. (2002) “Regulation of human cranial osteoblast phenotype by FGF-2, FGFR-2 and BMP-2 signaling.” Histol. Histopathol. 17(3):877-85.
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