【ScienCell】人关节软骨细胞（HC）产品使用攻略
人关节软骨细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
人关节软骨细胞
（HC）
关节软骨覆盖在骨头之间的关节处，不含血管、淋巴管或神经纤维，仅由一种特殊的细胞类型组成，即软骨细胞，它们产生和维护软骨的一系列胶原和非胶原的胞外基质大分子，包括II型胶原、聚集素、连接蛋白、IX型胶原和XI型胶原和蛋白聚糖（主要是聚硫酸软骨素）；此外，能够产生和响应大量的肽生长因子和细胞因子，包括类胰岛素生长因子-1和白细胞介素-1。软骨细胞增殖和分化的调控对于脊椎动物骨骼的协调发育至关重要。关节软骨耐磨性高，再生质量差，经分化后，对II型胶原和硫酸化蛋白聚糖染色呈阳性。软骨细胞的培养是研究软骨再生和修复、细胞因子和生长因子对软骨的影响、特定基因调控以及关节炎病理生理学的优秀模型。HC-a分离自人关节软骨，其S100B和type II collagen特异性荧光抗体染色呈阳性。
培养方式
培养瓶：PLL（多聚-L-赖氨酸）包被培养瓶。
培养基：HC-a用提供的CM完全培养基（包含基础培养基、5% FBS、5% CGS和1% P/S）培养。
操作步骤：
1) 包被PLL（2 μg/cm2）培养瓶（T-75培养瓶）的准备：将10 mL无菌水加入到T-75培养瓶中，加入15 μL聚-L-赖氨酸原液，轻轻吹匀后将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少1小时）。
2) 无菌水清洗包被PLL的T-75 2次，加入20 mL完全培养基，将解冻后的HC-a加入至包被的T-75中，十字交叉法轻柔摇晃培养瓶使细胞分布均匀，将培养瓶放入细胞培养箱中。（注：不建议在解冻后稀释和离心细胞，因为这些操作对细胞的伤害比培养中残留的二甲基亚砜（DMSO）的影响更大。同时，将细胞置于PLL涂层培养有助于促进细胞附着。）
换液：为了获得最佳结果，在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，之后每隔三天更换一次培养基，直到培养达到约70%的密度，一旦培养达到约70%的密度，每隔一天更换一次培养基，直到培养达到约90%的密度。
传代：当细胞密度达到90%-95%时进行传代。
1) 将T/E、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。
2) 弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除，加入5 mL DPBS和5 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱，一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入2 mL FBS（#0500）终止消化，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据5000 cells/cm2的密度传代至预先用PLL包被的培养瓶中。
生长条件：在CO2浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。
表 1 HC-a培养材料
参考文献
[1] Kolettas E, Muir HI, Barrett JC, Hardingham TE. (2001) “Chondrocyte phenotype and cell survival are regulated by culture conditions and by specific cytokines through the expression of Sox-9 transcription factor.” Rheumatology, 40(10): 1146-1156.
[2] Fosang A, Tyler JA, Hardingham TE. (1991) “Effect of interleukin-1 and insulin-like growth factor-1 on the release of proteoglycan components and hyaluronan from pig articular cartilage in explant culture.” Matrix 11:17-24
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